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Comparación de dos ensayos funcionales del receptor de lipoproteínas de baja densidad para el diagnóstico de la hipercolesterolemia familiar

Comparison of two funcional LDL-receptor assays for the diagnosis of familiar hypercholesterolemia

Y Suárez a, MA Lasunción b

a Servicio de Bioquímica-Investigación. Hospital Ramón y Cajal.
b Universidad de Alcalá de Henares. Madrid.

Palabras Clave

Receptor de LDL. Hipercolesterolemia familiar. Citometría de flujo. DiI. Proliferación celular.

Keywords

LDL receptor. Familial hypercholesterolemia. Flow cytometry. DiI. Cell proliferation.

Resumen

Fundamento. La causa más común de hipercolesterolemia familiar es la deficiencia del receptor de lipoproteínas de baja densidad (rLDL). La determinación de su actividad en el laboratorio es dificultosa, por lo que se rehúye y, en la mayoría de los casos, los criterios clínicos son suficientes para el diagnóstico y tratamiento de la enfermedad. Por otra parte, la búsqueda de mutaciones en el gen del receptor, aunque permite establecer con alta probabilidad de acierto la causa de la enfermedad, puede ser en vano cuando la causa de la hipercolesterolemia no reside en el receptor, por lo que sigue siendo necesaria la caracterización bioquímica del rLDL. Métodos. Con esta finalidad se aislaron células mononucleares de sangre periférica de individuos con hipercolesterolemia, se incubaron en un medio libre de colesterol para estimular máximamente la expresión del rLDL y se determinó la captación de LDL marcadas con el fluorocromo 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina (DiI-LDL) mediante citometría de flujo, expresándose los resultados de Bmáx de "captación de DiI-LDL" en porcentaje respecto al control. Al mismo tiempo, se estudió la capacidad de las LDL para revertir la inhibición de la proliferación producida por la lovastatina in vitro, calculándose la "tasa de recuperación por LDL". Resultados. Cualquiera de los métodos permitió distinguir claramente los pacientes con HF homozigota de los heterozigotos. Estos últimos presentaban disminuidas la "captación de DiI-LDL" (60,3 ± 1,5%) y la "tasa de recuperación por LDL" (56,4 ± 4,5%) con respecto a los controles. En conjunto, ambos parámetros están correlacionados pero existen casos que se alejan de este comportamiento, como los heterozigotos con defecto en la internalización y las alteraciones que no afectan al rLDL. Conclusión. Por tanto, ambos métodos son complementarios y permiten un diagnóstico fiable de la hipercolesterolemia.

Artículo

Introducción

Numerosas evidencias indican que las lipoproteínas de baja densidad oxidadas (LDLox) son un factor importante en la progresión de la arteriosclerosis1. Según esta hipótesis, las partículas de LDLox producen un incremento de la adherencia y acumulación de macrófagos en el espacio subendotelial de la pared arterial2, estimulan la proliferación de células del músculo liso3,4, favorecen la vasoconstricción arterial5,6 y producen trastornos en los procesos de apoptosis7,8 y trombosis9,10 en la placa de ateroma. El efecto antiaterogénico de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) parece estar vinculado, al menos en parte, a la presencia en estas partículas de enzimas que eliminan las LDLox11. Uno de estas enzimas es la paraoxonasa (PON1), una éster hidrolasa que destruye los fosfolípidos e hidroperóxidos oxidados12,13. La actividad PON1 en suero está determinada al menos por dos polimorfismos genéticos14, uno en la posición 55, que es una sustitución Met-Leu (isoformas M y L, respectivamente), y otro en la posición 192 que es una sustitución Gln-Arg (isoformas Q y R). Se ha descrito que las distintas isoformas pueden presentar eficacias diferentes en la protección contra la LDLox13, aunque otros trabajos no han confirmado estos resultados15. Recientemente, se ha propuesto la determinación del título de anticuerpos contra LDLox (Ac-LDLox) como un método indirecto para la estimación de la concentración plasmática de esta lipoproteína16,17. El presente estudio tiene como objetivo analizar si existe relación entre los valores plasmáticos de Ac-LDLox, la actividad PON1 y sus polimorfismos en el suero de individuos normales o pacientes que han sufrido un infarto de miocardio.

Pacientes y métodos

Pacientes

El estudio se llevó a cabo en muestras de suero y ADN de 39 pacientes participantes en un estudio anterior18, que sobrevivieron a un infarto de miocardio y a los que se localizó a través del examen de su historia clínica y se invitó a participar en el estudio. Todos los pacientes tenían una edad inferior a 55 años en el momento del episodio, y no tenían antecedentes de hipercolesterolemia familiar, insuficiencia renal o enfermedad hepática. Las muestras sanguíneas se obtuvieron al menos 3-4 meses después del episodio agudo. Como grupo control se estudiaron 39 sujetos sanos que participaron en un estudio epidemiológico que se llevaba a término en nuestra área19. Ambos grupos de individuos fueron elegidos para que la distribución de edad y sexo fuera similar y también en función de su genotipo PON1192, de manera que 13 sujetos eran homozigotos para Q, 13 para R, y 13 eran heterozigotos.

Determinación del título de Ac-LDLox

Se utilizó un enzimoinmunoanálisis en fase sólida (ImmuLisa, IMMCO Diagnostics, Buffalo, NY). Los sueros de los pacientes y los correspondientes calibradores se añadieron por duplicado a pocillos de plástico, uno de los cuales estaba recubierto con LDL nativa y el otro con LDLox. Las muestras se incubaron durante 2 h a 4 °C. Después de cuatro lavados, los pocillos se incubaron durante el mismo período de tiempo y a la misma temperatura con una solución de conjugado, que contenía un anticuerpo anti-IgG humana marcado con fosfatasa alcalina. Se repitieron los lavados y se añadió un sustrato que contenía p-nitrofenilfosfato. Después de una incubación a 4 °C durante 30 min, se leyó la absorbancia a 405 nm. Para cada muestra y calibrador se restó la absorbancia obtenida en el pocillo con LDL nativa de la correspondiente al pocillo con LDLox. Estos valores se interpolaron en la curva patrón. Los resultados se expresaron en UE/ml.

Determinación del genotipo de PON1 y de su actividad enzimática en suero

Se obtuvo ADN genómico de todos los pacientes y controles a partir de los leucocitos mediante técnicas convencionales (Puregene DNA Isolation Reagent Set, Gentra, Minneapolis, MN), y se determinaron los polimorfismos PON155 y PON1192 mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa y análisis de restricción con las enzimas NlaIII y AlwI (New England Biolabs, Beverly, MA)19.

La actividad PON1 se determinó mediante un método descrito previamente19 en un analizador automático Shimadzu CL-7200. Ocho μ l de suero se incubaron con 250 μ l de tampón glicina 0,05 M (pH, 10,5) con 1 mM CaCl2 y 1 mM paraoxon. El incremento en la absorbancia se determinó automáticamente a los 17 y 51 s. La actividad PON1 se expresó en U/ml.

Análisis estadístico

Dado que las distribuciones de los valores de Ac-LDLox y PON1 en suero no siguieron una distribución normal, los análisis estadísticos se llevaron a cabo después de su transformación logarítmica. Muchas de las muestras analizadas presentaron valores de Ac-LDLox inferiores al límite de detección de la técnica, asignándoseles un valor de 1 antes del cálculo del logaritmo. Las diferencias entre grupos se calcularon mediante ANOVA. Las correlaciones entre variables se calcularon con el coeficiente de correlación de Pearson.

Resultados

Los resultados de la actividad PON1 en el suero de los sujetos control y los pacientes con infarto de miocardio se indican en la figura 1. Tal como era de esperar, la actividad enzimática varió en función del genotipo, incrementándose significativamente (p < 0,001) en los portadores de los alelos R y M, tanto en controles como en pacientes. No hubo diferencias significativas en la actividad PON1 entre los dos grupos de estudio. Los resultados de las determinaciones de Ac-LDLox se recogen en la figura 2. No hubo diferencias significativas en los valores de este parámetro en los pacientes con infarto de miocardio con respecto a los sujetos control. Tampoco las hubo en función de los polimorfismos PON55 y PON192. No se observaron correlaciones significativas entre la actividad PON1 en suero y los valores de Ac-LDLox ni en controles (r = 0,11) ni en pacientes (r = 0,03).

Figura 1. Diagramas de caja que representan los resultados de la actividad PON1 en función de los polimorfismos en las posiciones 192 y 55, en sujetos controles (cajas blancas) y pacientes con infarto de miocardio (cajas sombreadas).

Figura 2. Diagramas de caja que representan los resultados del título de Ac-LDLox en función de los polimorfismos en las posiciones 192 y 55, en sujetos controles (cajas blancas) y pacientes con infarto de miocardio (cajas sombreadas).

Discusión

La oxidación de las partículas de LDL parece ser un importante factor proaterogénico. Diversos agentes antioxidantes presentes en el suero humano actúan previniendo la formación de lipoperóxidos en la LDL1. Otros agentes protectores no ejercen una función preventiva, sino que destruyen los lipoperóxidos neoformados en la LDL, suprimiendo así la propagación de la oxidación20. Se ha sugerido que uno de estos agentes es la PON113, una éster hidrolasa asociada a la HDL. La actividad de esta enzima varía mucho de un individuo a otro, y parte de esta variabilidad está relacionada con los polimorfismos del gen PON121. Una sustitución Gln-Arg en la posición 192 (isoformas Q y R) es determinante para la actividad hidrolítica contra el paraoxon, ya que el alelo R codifica una proteína con varias veces más actividad enzimática que el alelo Q22,23. Otra sustitución, Met-Leu en la posición 55 (isoformas M y L), tiene también efecto sobre la actividad enzimática y existe un fuerte desequilibrio de ligamiento entre las isoformas L y Q24.

Algunos estudios han encontrado una relación inversa entre la capacidad de la PON1 de hidrolizar paraoxon y sus efectos antiaterogénico y protector contra la oxidación de la LDL, de manera que se ha observado una mayor prevalencia del genotipo RR en sujetos con enfermedad cardiovascular que en individuos sanos25-28, y que el genotipo QQ es más eficiente que el genotipo RR hidrolizando los lípidos oxidados de la LDL29-32. Sin embargo, estos resultados están sujetos a controversia, ya que otros autores, entre los que se incluye nuestro grupo de investigación, no han encontrado ninguna asociación entre los polimorfismos de la PON1 y la enfermedad cardiovascular15,33-36.

El presente estudio se llevó a cabo con el objeto de saber si existía alguna relación entre el título de anticuerpos contra la LDL oxidada y la actividad PON1 en el suero o sus polimorfismos genéticos en individuos normales y en pacientes supervivientes de un infarto de miocardio. Los resultados obtenidos no demostraron ninguna relación entre estos factores. Los pacientes no presentaron valores de Ac-LDLox significativamente elevados con respecto al grupo control a los 3-4 meses después del episodio agudo, lo cual estuvo probablemente relacionado con la medicación o con cambios saludables en sus hábitos dietéticos. Asimismo, los valores de Ac-LDLox fueron independientes de los polimorfismos de la PON1 en las posiciones 55 y 192 y no se correlacionaron significativamente con la actividad enzimática. Estos resultados confirman y completan los obtenidos recientemente en sujetos sanos finlandeses, en los cuales tampoco se observó ninguna asociación entre el título de Ac-LDLox y los polimorfismos 55 y 19237.

Las conclusiones del presente estudio deben ser tomadas con cierta precaución. Si bien se ha sugerido que el título de Ac-LDLox es un buen marcador de la concentración de LDL oxidada en la enfermedad cardiovascular38 y en diversas situaciones clínicas en las que hay un incremento del estrés oxidativo, como la diabetes mellitus16,17, la insuficiencia renal crónica39 y la endometriosis40, otros autores han llegado a conclusiones discordantes38,41-44. Recientemente, se han desarrollado inmunoanálisis con anticuerpos dirigidos contra neoepítopos de la LDL oxidada1 que permiten la medida directa de su concentración; su uso permitirá investigar con mayor fiabilidad las relaciones entre este importante factor proaterogénico y la PON1.

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