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Factores involucrados en la fibrogénesis hepática

Factors involved in hepatic fibrogenesis

JA Solís Herruzo a

a Servicio de Aparato Digestivo. Departamento de Medicina. Hospital Universitario 12 de Octubre. Universidad Complutense. Madrid.

Artículo

La fibrosis hepática puede definirse como el resultado de la acumulación excesiva de matriz extracelular (MEC) en el hígado. En las fases iniciales puede tener una distribución focal dentro de cada lobulillo. En las fases más avanzadas puede formar bandas o tabiques gruesos que unen los espacios portales entre sí, o éstos con las venas eferentes. Por último, cuando estos tabiques son generalizados y rodean los islotes de células hepáticas, se puede utilizar el término de cirrosis hepática. La fibrosis es una lesión que aparece con independencia de la causa de la enfermedad, pero que se relaciona con su estadio evolutivo, por lo que su presencia se debe interpretar como un indicador de cronicidad. Además, la fibrosis hepática tiene significación pronóstica, ya que tiene importantes repercusiones fisiopatológicas. Por un lado, contribuye a aumentar las resistencias al flujo sanguíneo y con ello al desarrollo del síndrome de hipertensión portal. Por otro lado, su depósito en el espacio de Disse representa una barrera que dificulta el intercambio de nutrientes y metabolitos entre la sangre de los sinusoides y los hepatocitos. Además, en la actualidad no se puede seguir considerando la fibrosis como una sustancia inerte, residual, carente de actividad metabólica. Existen abundantes pruebas experimentales que indican que los componentes de la fibrosis influyen sobre la actividad de las células hepáticas y que la matriz extracelular no es una estructura estática, sino que, por el contrario, es extraordinariamente dinámica y dotada de una intensa actividad metabólica.

En este artículo revisaremos los principales mecanismos que intervienen en la regulación de la producción de MEC y que conducen a la fibrosis hepática. Para otros aspectos generales de la fibrogénesis hepática, composición de la MEC y tratamiento de la fibrosis se pueden consultar varias revisiones publicadas durante los últimos años1-5.

Los factores involucrados en la fibrogénesis hepática son numerosos y actúan en diferentes ámbitos. Los más importantes intervienen actuando sobre: a) la activación de las células estrelladas del hígado (CEH); b) la proliferación de estas células; c) la síntesis de la MEC; d) la degradación de la MEC, y e) muerte de las CEH por apoptosis. Sobre estos aspectos centraremos esta revisión.

ACTIVACION DE LAS CEH

Aunque es posible que todas las células del hígado estén capacitadas para la síntesis de los componentes de la MEC, en la actualidad nadie duda de que sean las CEH las que desempeñan el papel más importante en este proceso6. Estas células, también denominadas lipocitos o células de Ito, fueron identificadas, en 1876, por Von Kupffer, y denominadas stern zellen (células estrelladas). En el hígado normal se localizan en el espacio subendotelial de los sinusoides. Aunque normalmente no son visibles con el microscopio óptico, representan aproximadamente el 15% de todas las células del hígado y un tercio de las no parenquimatosas. Son células con un retículo endoplásmico rugoso y un aparato de Golgi muy poco desarrollado, lo que indica que tienen escasa actividad metabólica. Esta inactividad está avalada por el hecho de que su contenido en ARN mensajero (ARNm) de los colágenos III y IV y de la laminina sean muy escasos, y que el del colágeno I esté prácticamente ausente. Entre sus características ultrastructurales e inmunohistoquímicas figuran la expresión de la desmina, vimentina, laminina y tenascina, así como la presencia de multitud de finas gotas de ésteres de retinol que a la luz ultravioleta evidencian una autofluorescencia muy fugaz.

Cuando el hígado sufre alguna agresión, estas células cambian radicalmente su morfología y su actividad biológica. Desaparecen las gotas de vitamina A, se alargan, adoptan la morfología de los miofibroblastos, desarrollan un amplio retículo endoplásmico rugoso, expresan * -actina en su citoplasma6 y receptores del PDGF (platelet-derived growth factor) y del TGF ß (transforming growth factor beta) en la membrana celular, producen factores de crecimiento, citocinas inflamatorias y fibrogénicas (TGF ß , M-CSF [macrophage colony-stimulating factor], PAF [platelet-activating factor], IL-10, IL-6)7 y, por último, sintetizan y segregan gran cantidad de prácticamente todos los componentes de la MEC8.

Por lo que acabamos de referir, es fácil deducir que un factor que tiene un papel decisivo en la fibrogénesis hepática es el relacionado con la activación de las CEH. Sin embargo, conocemos sólo parcialmente los mecanismos por los que se produce. Sabemos que en ello intervienen señales procedentes de las células vecinas y de la misma MEC que las rodea. Los hepatocitos lesionados por el etanol, el virus de la hepatitis C, o la acumulación de hierro son fuente de lipoperóxidos que por vía paracrina pueden activar a las CEH9. Asimismo, las células de Kupffer del hígado lesionado y los macrófagos que acuden de otros lugares del organismo liberan factores mitogénicos (PDGF, TGF * , IL-1, TNF * [tumor necrosis factor alpha], IGF-I [insulin-like growth factor])10 que participan en esa activación. Las células endoteliales de los sinusoides suelen ser las primeras en sufrir la agresión inmunológica o por tóxicos. Además, a ellas se adhieren las células inflamatorias antes de iniciar su emigración al espacio intersticial. Estas células liberan factores de crecimiento (bFGF [basic fibroblast growth factor], HGF [hepatocyte growth factor]) y citocinas (IL-6, IL-1) y el activador del plasminógeno, que pueden inducir la activación de las CEH. También tienen un papel importante las plaquetas, los linfocitos y otras células inflamatorias que se acumulan en las zonas lesionadas. Los agregados plaquetarios depositados sobre las paredes de los sinusoides liberan multitud de factores de crecimiento, citocinas y quimioquinas (EGF [epidermal growth factor], PDGF, TGF ß ) que influyen sobre la actividad de las CEH. Igualmente, los linfocitos producen citocinas del tipo Th1 o Th2 que, además de sus efectos inmunológicos, ejercen efectos reguladores sobre las CEH7.

La fibronectina, un componente de la MEC producida por las células endoteliales de los sinusoides, también puede participar en la activación de las CEH. Estudios recientes han demostrado que la molécula de fibronectina celular producida durante la lesión hepática posee un segmento que es particularmente eficaz en la activación de esas células11. En los últimos años se ha avanzado mucho en el conocimiento de la transmisión intracelular de la señal provocada por la unión de la fibronectina a receptores tipo integrina.

Las integrinas son una familia de receptores presentes en la superficie de las células a los que se fijan las proteínas de la MEC, en especial la fibronectina, aunque también lo hacen la vitronectina, el colágeno y la laminina12 (fig. 1). Se trata de glucoproteínas heterodiméricas de las que se conocen al menos 16 unidades alfa y 8 beta, que al combinarse entre sí originan unos 20 receptores diferentes. Estas proteínas, además de hacer de receptores, pueden traducir señales al interior de las células, con la participación de tirosincinasas, serina/treonina cinasas, mediadores lipídicos, GTPasas de bajo peso molecular y el flujo intracelular de calcio. Estas vías regulan una serie de funciones celulares, incluyendo la proliferación, la migración y la apoptosis13. Se sabe que tras la unión de las proteínas de la MEC a las integrinas, se produce la activación de FAK (focal adhesion kinase)14. Se trata de una tirosincinasa citoplásmica que tiene un papel clave en la transmisión de señal generada por las integrinas13. Su tirosinfosforilación se sigue del reclutamiento de la Srck (Src kinase) y de la fosforilación de diversas proteínas. Además de la FAK y de la Srck, existen bases para pensar que también intervienen otras moléculas en la transmisión de la señal, como la Pl3K (phosphatidylinositol 3 kinase), la PLC * (phospholipase C * ) y la PKC (phosphokinase C)15.

Las CEH poseen una gran variedad de integrinas en su membrana y se ha comprobado que cuando se unen a ellas moléculas de MEC (fibronectina, laminina, colágenos I o IV) se produce un aumento de la actividad tirosín fosforilativa de FAK. Lo mismo ocurre cuando las células son tratadas con PDGF. Entre las enzimas activadas por FAK figura la Pl3K y la PKC. La primera es también un heterodímero capaz de asociarse a FAK como respuesta a su activación por la fibronectina o por el PDGF16. La PI3K interviene en los procesos de proliferación celular, apoptosis y migración. A FAK también se une la Grb2, a través de la cual puede iniciar la activación de la vía de Ras/MAPK. Otras proteínas que se unen a FAK son la p130Cas y la praxillin. Algunas funciones celulares parecen reguladas por esta vía de la FAK/Src. Entre éstas figura la diseminación, crecimiento, proliferación, migración celular y defensa frente a la muerte por apoptosis o más exactamente por anoikis. FAK aumenta la síntesis de ADN y acelera la transición G1/S1, probablemente con la participación de la Pl3K y de la ciclina D1. Además, también parece que interviene en la mediación de la activación de la familia Erk de las MAP cinasas que inducen la mitogénesis y la regulación del crecimiento celular13. En colaboración con FAK probablemente actúa tambien la PKC. Esta enzima se activa en muchas células cuando citocinas o factores de crecimiento se fijan a sus receptores. Esta unión se sigue de la hidrólisis del fosfatidilinositol 4,5-difosfato y de la formación de diacilglicerol. Este glicerol provoca la traslocación de la PKC desde el citoplasma a la membrana celular y, con ello, su activación. Esta enzima fosforila diversas proteínas que intervienen en la regulación del ciclo celular y de otras funciones de la célula. Los estudios destinados a conocer si la PKC interviene en la activación de las CEH han mostrado evidencias a favor de ello. Por ejemplo, la inhibición selectiva de la PKC con queleritrina impide que las CEH expresen * -actina y que proliferen15, mientras que su tratamiento con PDGF o con ésteres de forbol (PMA) se sigue de la activación de ERK17. Se supone que el PDGF aumenta la fosforilación de MARCKS (myristolate alanin-rich C kinase substrate), que es una proteína que influye en la organización del citosqueleto y en la progresión del ciclo celular.

Otra de las consecuencias de la agresión tisular es la degradación de la MEC. Ésta puede ser provocada directamente por la agresión, pero también puede serlo por las enzimas proteolíticas lisosomales liberadas por las células dañadas o por los neutrófilos que acuden al lugar de la lesión. Aun cuando la MEC del hígado normal no es abundante, en ella están retenidos factores de crecimiento y citocinas que quedan en libertad cuando esa matriz es degradada. Entre los factores que habitualmente están atrapados en la MEC figuran el bFGF, la IL-3, el M-CSF, que se hallan unidos a la cadena de heparina o de sulfato de heparán, o el EGF y el TGF ß , que se fijan al eje proteico de los proteoglicanos (decorín, biglicán) y el HGF, el PDGF y el VEGF. Algunos de estos factores, cuando son liberados, pueden también inducir la activación de las CEH. Si todos los factores mencionados pueden llevar a que las CEH pasen de su forma latente a la activa, una vez que estas células están activadas adquieren la capacidad de producir factores de crecimiento (PDGF, TNF * , FGF, TGF * , EGF) que, por vía autocrina, contribuyen a su propia activación y proliferación18,19.

La actuación de estos factores de crecimiento y citocinas sobre las CEH requiere su unión a receptores específicos presentes en la membrana celular. En las CEH en reposo se ha identificado la presencia de receptores de PDGF y TGF ß ; sin embargo, su número aumenta de forma muy llamativa tras la activación celular20.

Conocemos muy poco sobre los mecanismos intracelulares que intervienen en la transformación morfológica de las células y en la activación de la expresión genética de las proteínas sintetizadas por las CEH, pero parece que en ello intervienen diversos factores de transcripción, en especial AP1, NF * B, Zf9 y c-myb.

AP1 (activator protein 1)

AP1 es un factor de transcripción formado por homo o heterodímeros de proteínas de las familias Jun (c-Jun, JunB, JunD) y Fos (c-Fos, FosB, Fra-1 y Fra-2). Son factores que pertenecen al grupo de proteínas bZIP que se unen al ADN. En ellos se puede identificar una región transactivadora, otra de unión al ADN y otra de tipo cremallera (leucine zipper) que actúa como interfase de dimerización. AP-1 se une en forma de dímero a determinados elementos del promotor de algunos genes e induce su transcripción. La activación de este factor está relacionada con la vía de la ERK (early response kinase) (fig. 2). La ocupación y dimerización de receptores tirosín cinasa se sigue de la autofosforilación de una tirosina de su porción intracelular. A esta región fosforilada se le une la proteína intermediaria Grb2 (growth factor receptor-binding adaptor protein 2) que tiene un punto para su unión a Sos (Son-of-sevenless). Esta cadena de proteínas concluye en la pequeña proteína G de membrana denominada Ras. Esta pasa de su forma inactiva (GDP-Ras) a su forma activa (GTP-Ras). A partir de ese momento se inicia una cascada de fosforilaciones sucesivas que finaliza en la activación genética. Eslabones de esa cadena son la Raf-1, que fosforila a MEK (MAP kinase/ERK-activating kinase) y éste a ERK en los residuos específicos treonina y tirosina. Una vez que ERK ha sido fosforilado se trasloca al núcleo, donde fosforila a factores de transcripción, como Elk-1/TCF, que aumenta la expresión genética de c-fos. La proteína c-Fos uniéndose a c-Jun forma el heterodímero AP-1 (fig. 1)21. Los efectos del PDGF sobre las CEH están mediados por esta vía, como lo sugiere el que inhibidores de MEK (PD98059) anulen estos efectos15. Sin embargo, es posible que también tenga algún papel la Pl3K22. Otra vía que se activa tras la ocupación de los receptores por los correspondientes factores de crecimiento o citocinas es la JNK/SAPK (Jun N-terminal kinase/Stress-activated protein kinase). La vía es muy parecida a la de la ERK, con la diferencia de que en lugar de Ras, participa la pequeña proteína G, llamada Rac, que activa a la PAK (p21-activated kinase)23. La JNK fosforila dos proteínas, la c-Jun y la ATF2. Ambas se unen formando un heterodímero que se fija al promotor del gen c-jun y activa su expresión. Además, la JNK contribuye a aumentar la actividad transactivadora de AP-1 al fosforilar a c-Jun de los dímeros Fos/Jun o Jun/Jun. El TNF * y la IL-1 activan a las CEH a través de esta vía.

NF * B

Otro de los factores de transcripción involucrados en la activación de las CEH es el NF * B. Es un factor que es activado por citocinas, metabolitos reactivos del oxígeno24 y mitógenos y que influye sobre la expresión de un gran número de genes relacionados con la inflamación, infección y el estrés (fig. 3). Se trata de un heterodímero formado por el p50 (NF * B1) y el p65 (NF * B2) que habitualmente se encuentra en el citoplasma unido a la proteína inhibidora I * B * o I * B ß 25. Tras el estímulo celular por citocinas o factores de crecimiento, I * B se fosforila en las serinas 32 y 36 y se degrada proteolíticamente en los proteosomas. Con ello el NF * B queda libre y puede traslocarse al núcleo y fijarse a los genes que tienen secuencias consenso para él, como, por ejemplo, los relacionados con la respuesta de fase aguda, las inmunoglobulinas, citocinas y moléculas de adhesión. Su actividad transcriptiva se refuerza, además de por su unión al ADN, por su fosforilación26. También se refuerza ese efecto cuando el NF * B se une a AP-1. En las CEH, se ha demostrado que es capaz de activar los genes de ICAM-127, MCP-1, IL-6, MIP-228 y CINC (cytokine-induced neutrophil chemoattractant)29, entre otros. Recientemente se ha identificado un complejo enzimático que es el responsable de la fosforilación de las serina 32 y 36 de I * B * y las serinas 19 y 23 de la I * B ß y, por tanto, de la liberación de NF * B. Son las denominadas IKKs (I * B kinases). Se trata de proteínas diméricas (IKK * , IKK ß ), que poseen una región cinasa para serina/treonina en su extremo amínico, una cremallera de leucina por la que se unen a otros monómeros para formar dímeros y la región HLH (helix-loop-helix) en su extremo C por el que se interrelaciona con IKK * . Esta última representa la subunidad reguladora de la actividad del complejo. Tanto la IKK * como la IKK ß son activadas por citocinas, por ejemplo por el TNF * 24. Parece que la unión de determinadas citocinas a sus correspondientes receptores se sigue de su acoplamiento a la molécula TRADD, a la cual lo hacen las moléculas Traf-2, RIP y FADD. Mientras que la última es mediadora de la muerte celular por apoptosis, las primeras activan la enzima NIK (NF * B inducing kinase) que es la encargada de fosforilar al complejo IKK30. Durante la activación de las CEH se produce un marcado aumento del NF * B nuclear31, lo que permite suponer que desempeña un papel crítico en la activación de las CEH.

Zf9

El grupo de Friedman ha identificado un nuevo gen, el Zf9 (Zinc finger 9 o CPBP)32 que es rápidamente inducido tras la lesión hepática33. Mientras que en las CEH inactivas, este gen apenas se expresa, en las activadas su expresión y biosíntesis aumenta de forma muy llamativa. En estas células se le puede identificar en el núcleo y en la zona perinuclear de las CEH. El análisis de la secuencia de nucleótidos del gen Zf9 indica que se trata de un miembro de la familia Kruppel y que posee una región N terminal rica en grupos serina-prolina y leucinas. Este gen se localiza en el hombre en el cromosoma 10p. El factor Zf9 se une a elementos del ADN ricos en G+C, al igual que lo hacen los diversos miembros de la familia Sp. Su importancia fisiológica no está bien establecida, pero se sabe que puede estimular la expresión del colágeno * 1(I), sinergizar los efectos del Sp1, transactivar el promotor del TGF ß y de los receptores de éste y parece que participa en la activación de las CEH.

c-myb

Otro aparente regulador de la proliferación celular y de su diferenciación es el c-myb. En los pacientes con hepatitis virales crónicas así como en las zonas de inflamación activa se han encontrado tasas elevadas de este factor en las CEH34. Su papel en la activación de estas células se ha demostrado al comprobar que si se bloquea su expresión genética con oligonucleótidos antisentido o su actividad con anticuerpos específicos, no se produce activación de las CEH31.

Una vez que las CEH se han activado, se produce en ellas una serie de cambios que determinan su depleción de retinoides, proliferación, quimiotaxis, liberación de citocinas, contractibilidad, fibrogénesis y degradación de la MEC. Esta gran variedad de cambios es reflejo del gran número de nuevos genes que están activos en estas células. Nos ocuparemos sólo de los cambios más directamente relacionados con la fibrogénesis hepática, es decir, de la proliferación de las CEH, y la síntesis y degradación de la MEC.

PROLIFERACION Y QUIMIOTAXIS DE LAS CEH

En las zonas lesionadas del hígado se puede comprobar que existe un marcado aumento del número de CEH. Esto es originado tanto por la proliferación de las células ya existentes, como por la llegada de otras nuevas desde zonas vecinas. La proliferación celular se debe a estímulos proliferativos que suelen tener en común su actuación a través de receptores tirosín cinasa. Entre los estímulos proliferativos mejor caracterizados y más potentes figura el PDGF. Tras la lesión hepática se produce un aumento de PDGF y de su receptor celular. Su unión a su receptor pone en marcha una cascada intracelular mitogénica en la que participa la molécula Ras, la vía ERK/MAPK, el calcio intracelular, el ascenso del pH, la activación de la PI3K, de la PLC (phospholipase C) y de las moléculas STAT-1, CREB, c-Fos, c-Jun y c-Myc. Estos últimos, son factores que influyen sobre el ciclo celular y, por tanto, que activan la divisón celular. Otros mitógenos que también pueden activar la proliferación de las CEH son la trombina, el bFGF, el IGF-I e IGF-II, el EGF, el TGF * y el VEGF (vascular endothelial growth factor)6. Receptores para este último factor se encuentran no sólo en las células endoteliales, sino también en las CEH, lo que hace suponer que estas células participan en la respuesta angiogénica a la lesión. El TNF * liberado por los monocitos activados también modula la proliferación de fibroblastos tras aumentar el número de receptores del EGF, un potente mitógeno.

La llegada a la zona hepática lesionada de nuevas células procedentes de otras áreas vecinas contribuye al aumento de CEH que se observa en las zonas dañadas. El PDGF, además de tener un papel en la proliferación celular, se comporta como un potente agente quimiotáctico para las CEH activadas35. Además, el TGF * atrae también a la zona de la lesión a fibroblastos, miocitos y monocitos.

PRODUCCION DE MEC

Una vez activadas las CEH y aumentado su número, estas células están en condiciones de responder a la agresión con la producción de los componentes de la MEC. Ésta está constituida por proteínas de naturaleza muy diversa, pero incluibles en alguna de las siguientes categorías: a) colágenos (I, III, IV, V, VI); b) glucoproteínas (fibronectina [FN], laminina [LM], entactina, tenascina, trombospondina y undulina); c) proteoglicanos (sindecán, trombomodulina, betaglicán, versicán, biglicán, decorín, fibromodulina y perlecán), y d) glucosaminoglicanos1,2. De todos ellos, el colágeno I constituye la proteína dominante en la fibrosis hepática. Por esta razón, es por lo que ha sido más estudiada y la regulación de su expresión es mejor conocida.

El colágeno I es el producto de dos genes, el * 1(I) y el * 2(I), que, aunque localizados en dos cromosomas diferentes (17 y 7, respectivamente), están regulados de forma coordinada. La regulación de la síntesis de colágeno se puede producir a nivel transcripcional y postranscripcional.

Regulación transcripcional de la síntesis de colágeno

En la CEH activadas, el ARNm del colágeno * 1(I) aumenta unas 60 a 70 veces, en comparación con el existente en las CEH inactivas. En los últimos años se ha progresado mucho en el conocimiento de la organización íntima de estos genes36. La mejor conocida es la de la cadena * 1 del colágeno I, pero una organización parecida se mantiene en el gen responsable de la cadena * 2(I) (fig. 4). El gen de la cadena * 1(I) posee un promotor de unos 2,5 kb, pero la zona más decisiva en la regulación de la transcripción genética se concentra en una pequeña región de unos 330 pb. En esta zona se sitúan todos los elementos imprescindibles para que se produzca la transcripción. En ella existe una secuencia TATAAA (­27 a ­21), dos regiones CCAATT invertidas situadas en continuidad de otras dos regiones ricas en G+C (GGGCGGG) localizada una entre los nucleótidos ­103 a ­82 (FP1) y la otra entre ­129 y ­110 (FP2). El análisis de las zonas protegidas de su digestión por la DNasa I ha evidenciado que existen otros dos elementos que fijan proteínas. Uno se sitúa entre ­190 y ­170 (FP4) y otro entre ­161 y ­133 (FP3). A las regiones ricas en G+C de los FP1, FP2 y FP3 se unen factores de la familia Sp, principalmente el Sp1 y el Sp3. Estos factores se comportan como potentes transactivadores37. Es posible que a esas mismas regiones se fije el factor Zf9 y que sus efectos sinergizen con los de Sp133. A los FP3 y FP4 es posible que se una el factor c-Krox38. Se trata de una proteína zinc-finger que fija a los elementos ricos en G+C del ADN. Aunque algunos autores le han atribuido un efecto activador de la transcripción39, éste no ha podido ser confirmado por otros investigadores40. En los fibroblastos, aunque no en las CEH, a los elementos CCAAT parece unirse el NF1, un factor de transcripción con capacidad para unirse a esas secuencias. Tras la activación de las CEH, aumenta la unión de NF1 a esas regiones y aumenta la expresión genética del colágeno40. Algunos autores han comunicado que el acetaldehído puede inducir la unión de NF1 a sus secuencias consenso en el promotor del colágeno41. En la posición ­1680 pb, se ha identificado un elemento que responde a las estímulos vehiculizados por la vía Ras/Raf-1/MAPK y que permite la unión de una proteína de 60 kDa con función activadora42. También la unión de Sp1/NF1 al FP1 parece depender de esta misma vía. En la proximidad del extremo 5' del promotor se ha identificado un elemento de respuesta al TGF ß . En la regulación de la expresión del colágeno participan otras regiones, además del promotor. Diversos autores han demostrado que en el primer intrón y en la región no traducida del extremo 3' existen elementos activadores y frenadores del colágeno que intervienen en esa regulación. Al extremo 3' se ha visto que pueden unirse los factores USF1 y USF2 (upstream stimulatory factor)43, que parecen comportarse también como activadores de la expresión genética.

El NF * B, cuya actividad aumenta de forma considerable durante la activación de las CEH, parece comportarse como un inhibidor de la expresión del colágeno * 1(I) y de otras proteínas de la MEC44. El mecanismo de esta frenación es desconocido, pero podría estar relacionado con su capacidad para unirse al Sp1 y, por ello, impedir que este factor activador pueda unirse al ADN.

Factores que influyen en la regulación transcripcional de la expresión del colágeno * 1(I)

Factores estimulantes

 

En la actualidad sabemos que existen factores que contribuyen a aumentar la expresión genética del colágeno y otros a reducirla. Entre los factores que aumentan la expresión genética figuran el acetaldehído, algunos metabolitos derivados de las lipoperoxidaciones y el TGF ß 1.

 

Acetaldehído. El alcohol es la causa más frecuente de cirrosis hepática en los países occidentales. Aunque esta lesión habitualmente se desarrolla en hígados con cambios necroinflamatorios, en los mandriles y ocasionalmente en el hombre, la exposición prolongada al etanol puede provocar fibrosis en ausencia de necrosis y de inflamación. Ello ha sugerido que el etanol pudiera ser un factor fibrogénico directo. Sin embargo, la adición de etanol a cultivos celulares de fibroblastos o de CEH no confirma estos efectos. Por el contrario, el acetaldehído, primer metabolito resultante de la oxidación del etanol, ha demostrado que es capaz de aumentar la síntesis del colágeno en cultivos de fibroblastos y de CEH45,46. Además, en estas mismas células, aumenta la actividad de la transcripción y la expresión genética del colágeno * 1(I) y colágeno * 1(III)46 y de otras proteínas de la MEC, mientras disminuye la expresión de las metaloproteinasas47. La ausencia de efectos del etanol sobre cultivos puros de fibroblastos o de CEH se puede explicar por la ausencia de alcoholdeshidrogenasa en esas células. Por ello se ha sugerido que el etanol es oxidado en los hepatocitos y que el acetaldehído llegaría a las CEH estimulando la expresión genética de las proteínas de la MEC. A favor de esta hipótesis están los resultados obtenidos tras la adición de etanol a cocultivos de hepatocitos con CEH. En estos casos se obtiene un marcado aumento de la expresión genética del colágeno * 1(I)46. Desconocemos el mecanismo por el que el acetaldehído origina ese estímulo, pero se sabe que el acetaldehído se une covalentemente a diversas proteínas, en especial a los grupos * -amino de la lisina, formando conjugados con propiedades biológicas diferentes a las de las proteínas intactas. En este sentido se ha sugerido que su unión a histonas H1, proteínas represoras de la transcripción genética, impediría su unión al ADN y anularía su actividad inhibitoria. Además, el acetaldehído aumenta los factores nucleares de NF1 y su unión al ADN48.

 

Lipoperoxidaciones. En numerosas circunstancias patológicas (siderosis, porfiria, aterosclerosis, etanol, bleomicina, tatracloruro de carbono) asociadas con lesión tisular y fibrosis, se produce la peroxidación de los lípidos de las membranas celulares. Consecuencia de ello es la formación de aldehídos altamente reactivos, como el aldehído malónico y el 4-hidroxinonenal49. En la actualidad contamos con multitud de evidencias que indican que estos metabolitos activan la expresión de los genes de la MEC y la fibrogénesis. Badosa50 mostró que el ARNm colágeno * 1(I) se colocalizaba junto con conjugados proteicos del malonildialdehído. La misma observación ha sido realizada en el hígado de animales con sobrecarga de hierro. El tratamiento con antioxidantes reduce la formación de conjugados proteínas-aldehídos y la expresión de los genes relacionados con la MEC51. La inducción de lipoperoxidaciones con una combinación de cloruro férrico, ácido ascórbico y citrato sódico, se sigue de un marcado aumento de la producción de colágeno y de la expresión genética del colágeno * 1(I). Estos efectos pueden evitarse si las células son previamente tratadas con antioxidantes, se incrementa el contenido celular de glutatión o se impide la formación de conjugados proteína-aldehído con el 5-piridoxal fosfato o con el p-hidroximercuribenzoato sódico. El papel de estos metabolitos derivados de las lipoperoxidaciones queda demostrado por el hecho de que la adición de malonildialdehído a las células también se sigue de un aumento de la síntesis de colágeno y de los valores celulares de ARNm colágeno * 1(I). Los mecanismos íntimos por los que estos aldehídos reactivos estimulan la fibrogénesis son desconocidos, aunque se puede especular que sean comunes a los del acetaldehído. Nosotros hemos demostrado que tanto las sales de hierro como el malonildialdehído actúan aumentando la unión de Sp1 y Sp3 a un elemento del promotor situado entre ­129 y ­110 bp. Sp1 y Sp3 son 2 proteínas nucleares con un potente efecto activador de la expresión genética. Estos efectos desaparecen si las células son tratadas con antioxidantes, se bloquea la formación de conjugados o se frena la síntesis de novo de proteínas. El aumento de la unión de Sp al promotor del colágeno va precedido de un aumento de los niveles celulares de Sp1 y Sp3 y de sus respectivos ARNm. Por lo indicado, los aldehídos derivados de las lipoperoxidaciones y, quizá también, el acetaldehído inducen la expresión genética de Sp1 y Sp3, lo que se sigue de su unión al promotor del colágeno * 1(I) y del estímulo de su expresión genética.

 

TGF ß . Se trata de una familia de hormonas peptídicas que son producidas y segregadas principalmente por las células inflamatorias y por las plaquetas y que desempeñan un papel importante en la embriogénesis, inflamación, carcinogénesis, inmunosupresión, proliferación y diferenciación celular y en la fibrogénesis. En relación con esta última, contribuye a aumentar el grado de fibrosis actuando a varios niveles, entre otros estimulando la síntesis de proteínas de la MEC y frenando su degradación. El TGF ß 1 es secretado por las células en forma de un homodímero latente que debe ser activado mediante la separación de la LAP (latency-associated peptide) y el LTBP (latent TGF ß 1 binding protein). Cuando se produce esa separación queda un homodímero de 25 kDa, que es el TGF ß 1 activo. Por esta razón, los efectos biológicos del TGF ß 1, requieren la unión de su forma latente a receptores manosa-6-fosfato/IGF-II de la superficie celular. Esta unión se hace gracias a grupos manosa 6 fosfato existentes en la LAP y en el LTBP. La separación de los péptidos inhibitorios se realiza por la actuación del plasminógeno activado por el activador de plasminógeno liberado por las células endoteliales. El TGF ß 1 activo se une a receptores celulares TGF ß R tipo II, lo que se sigue de la unión de los receptores tipo I y su fosforilación. Este conjunto, TGF ß /receptor II/I, posee actividad serina cinasa, lo que provoca la fosforilación de los factores R-Smad (Receptor-regulated Smad), en especial Smad-2 y Smad-352. Estas proteínas tienen en común que poseen un elemento MH1 (mad homology) en su extremo amínico y otro MH2 en su extremo carboxílico. En este último, es característica la secuencia serina-serina-X-serina, de la que sus dos últimas serinas sirven de diana para su fosforilación por el TGF ß -R-I. Una vez fosforiladas, R-Smad forma un complejo heteromérico con Co-Smad (common mediators-Smad) que pasa la membrana nuclear y se dirige a diferentes genes, entre otros, al del colágeno y a los de las colagenasas, ciclo celular, moléculas de adhesión, etc. No es ésta la única vía que tiene el TGF ß de influir sobre la actividad celular. Por ejemplo, se sabe que el TGF ß puede utilizar la vía de la TAK-1, una serina/treonina cinasa de la familia de las MAP cinasa cinasa cinasa. Igualmente, las pequeñas proteínas G, Ras y Rac y ciertas MAP-cinasas, tales como las ERK-1 y ERK-2, la SAPK/JNK han sido implicadas en la transmisión de señal del TGF ß 53. Se han descrito varias regiones en el gen del colágeno * 1(I) que pudieran responder al TGF ß , pero no se ha podido decidir cuál es la zona concreta. Una se sitúa entre los nucleótidos ­340 y ­23553. Es el CyRE (cytokine-responsive element). Para algunos, se trata de un elemento sobre el que inciden factores muy diversos (acetaldehído, TNF * ). Aunque posee secuencias consenso para el NF1, SP1, AP-1 y NF ß B, no contamos con evidencias de que alguno de esos factores se una realmente a esa región54,55. Más aceptado por todos los investigadores es un elemento localizado en la mitad 5' del promotor del colágeno * 1(I).

En la activación del gen del TGF ß , el factor nuclear Zf9, ya mencionado, tiene también un papel importante. En esta función se encuentra sinergizada por el Sp156. En su activación interviene no sólo la plasmina sino también el activador del plasminógeno y el ácido 9 cis-retinoico57. Además, la liberación del TGF ß por las CEH está regulada intracelularmente por diversas proteínas fijadoras58. Una de ellas es la ya mencionada, la LTBP, que puede modificar la disponibilidad biológica del TGF ß . Por último, su actividad fuera de las células puede ser modulada por su unión a las proteínas de la matriz extracelular, en especial al decorín, la laminina y a los colágenos I y IV.

Factores inhibidores de la expresión genética del colágeno * 1(I)

Entre los factores que pueden descender la expresión genética del colágeno figuran las interleucinas 1 y 10, el TNF * 59, la vitamina E, los glucocorticoides, los retinoides, los péptidos terminales del colágeno I y III, los agonistas adrenérgicos, el calcio y el interferón * .

TNF * . No se conoce bien el mecanismo íntimo por el que el TNF * frena la expresión genética de las proteínas de la matriz extracelular. Estudios propios han demostrado que esta citocina ejerce un efecto inhibitorio actuando sobre una región del gen del colágeno * 1(I) situada en la porción 5' no traducida del primer exón (+68 a +86 pb). Se trata de una región rica en G y C, a la que se une el factor activador Sp1. El TNF * impediría esa unión a través del componente p65 del NF * B translocado al núcleo44.

Los retinoides inhiben tanto la proliferación de las CEH como la síntesis y secreción de colágeno60. Sin embargo, estos efectos se observan en los cultivos celulares, pero no en el animal de experimentación cuando en ellos se induce una lesión hepática con tetracloruro de carbono o etanol61, ni en el hombre sometido a tratamiento crónico con vitamina A62. En estos casos, en contra de lo esperado, se comporta como un agente fibrosante. Este efecto es atribuido al papel que tiene como activador del TGF ß que hemos comentado anteriormente57.

El IFN * liberado por los linfocitos se comporta como un potente inhibidor de la fibrogénesis hepática, tanto in vivo63 como in vitro64.

Los corticoides inhiben la síntesis de colágeno a diversos niveles (activación de las CEH, transcripción genética, inestabilidad del ARNm del colágeno, reducción de la actividad de las prolil y lisilhidroxilasas)65 además de por sus efectos antiinflamatorios. En un modelo experimental de esquistosomiasis murina, se pudo comprobar su eficacia en la prevención de la fibrosis hepática.

Las prostaglandinas, en especial la 16,16 dimetilprostaglandina E2, han demostrado poseer efectos antifibrosantes en modelos experimentales de fibrosis y cirrosis hepática, pero los mecanismos de actuación son probablemente múltiples. Entre ellos figura la mayor resistencia de los células a las agresiones, la mayor degradación intracelular del colágeno y la inhibición de la transcripción genética66.

Interleucina-10. La IL-10 es una citocina reguladora producida por las células Th2, macrófagos, células cebadas y células B. En el hígado, además, es producida por los hepatocitos, células de Kupffer y CEH. En general se comporta como una citocina antiinflamatoria y frenadora de las células Th1 y de macrófagos. Sobre las primeras actúa inhibiendo la expresión del IFN * y de la IL-2. Sobre los macrófagos actúa suprimiendo la presentación de antígenos a las células Th1, así como la producción y activación de citocinas. Por el contrario, estimula la función de las células B y cebadas. Además de estos efectos inmunorreguladores, posee otros antifibrogénicos. In vivo, esta actividad puede explicarse por sus efectos antiinflamatorios, pero no en los cultivos celulares. En éstos, se ha probado que reduce la expresión del gen del colágeno * 1(I) y la respuesta al estímulo con TGF ß 67. Este efecto probablemente tenga aplicación terapéutica, como lo indica que, en pacientes con hepatopatías crónicas tratados con IL-10, la intensidad de la fibrosis disminuya (D. A. Brenner, comunicación personal).

Regulación postranscripcional de la síntesis de colágeno

En los últimos años, se ha comprobado que el ritmo de degradación del ARNm del colágeno tiene un papel muy importante en la regulación de la expresión genética de esta proteína. Más arriba mencionábamos que, durante la activación de las CEH, los valores celulares de ARNm del colágeno * 1(I) aumentan entre 60 y 70 veces el nivel existente en las células en reposo. Este aumento se debe, en parte, a que la tasa de transcripción genética aumenta unas 3 veces, pero en gran medida ello se justifica porque la vida media del ARNm aumenta desde 1,5 h a 24 h68. Es bien sabido que las proteínas de las células muy especializadas (eritrocitos), que requieren la acumulación de grandes cantidades de proteínas para realizar su función (hemoglobina) suelen depender de ARNm de vida media muy larga. Por el contrario, las proteínas de expresión muy fugaz (c-Myc) suelen proceder de ARNm de vida muy corta69. La estabilidad del ARNm depende de algunos elementos situados en sus extremos. El extremo 5' posee una estructura en forma de caperuza (m7G cap), mientras que el 3' se encuentra poliadenilado. Al extremo 5' se une una proteína que impide la digestión de ese extremo por las 5'-3' exorribonucleasas, mientras que al extremo poli(A) se une la PABP (poli(A)-binding protein) que le protege de su digestión por las 3'-5' exorribonucleasas. Además de estos dos elementos terminales del RNAm, existen otros que también pueden contribuir. La mayoría de éstos se sitúan en la zona 3'UTR (3' untranslated region). Una familia de proteínas con esa función que ha sido identificada es la * CP1 y la * CP2 ( * -complex proteins). Se trata de proteínas que son esenciales para formar el complejo * , y éste, formado por al menos 6 proteínas diferentes, desempeña un papel decisivo en la duración de la vida del ARNm, ya que determina la tasa de deadenilación del extremo 3'. Para ello se combinan con la proteína PABA e impiden la degradación del extremo 3' poli(A). Se ha demostrado que en las CEH activadas estas proteínas CP se unen al 3'UTR del ARNm del colágeno * 1(I)68 y que participan en la regulación postranscripcional de la expresión genética del colágeno * 1(I). En la región 5'UTR del ARNm de los colágenos * 1(I), * 2(I) y * 1(III) existe una estructura en forma de asa que está muy conservada68,70. Stefanovic et al han demostrado que esa asa influye negativamente sobre la vida media del ARNm del colágeno * 1(I), de forma que en las CEH inactivas impide la acumulación de ARNm del colágeno * 1(I). A esta asa se une una proteína de unos 120 kDa que la cubre y prolonga la supervivencia del ARNm. Todas estas proteínas están presentes en las células activadas, pero no en la inactivas. Se supone que en las CEH activas, el * CP se une a la región 3'UTR e interactúa con la proteína que se une al asa 5' y con la PABP. Estas interacciones aumentan la estabilidad del ARNm y su traducción. Además, parece que algunas proteínas pueden reconocer simultáneamente el asa 5' y la proteína m7G-cap, facilitando la entrada del ARNm en el correspondiente ribosoma (Brenner, comunicación personal).

DEGRADACION EXTRACELULAR DE LA MEC

La cuantía de MEC existente en un órgano en un momento determinado es el resultado, no sólo del grado de su síntesis, sino también del de su degradación. En condiciones normales, ambos procesos se producen de forma coordinada, de manera que ambos están equilibrados. El resultado de esto es que cada órgano contiene la cantidad de MEC necesaria para la conservación de su estructura y para su correcto funcionamiento. Cuando se produce una lesión, aumenta la producción de MEC por encima de la degradación, dando lugar a la formación de una cicatriz.

La degradación del colágeno se inicia dentro de las células que lo sintetizan, antes de ser secretado, y se continúa en el medio extracelular. Se estima que entre el 15 y el 40% del colágeno producido por las células se destruye cuando aún permanece en su interior. Éste proceso es especialmente intenso cuando la prolina no es hidroxilada y el colágeno no adopta la disposición helicoidal que lo caracteriza. En este proceso interviene el adenosín monofostato (AMP) cíclico. Algunas sustancias que elevan los niveles celulares de este último han evidenciado que previenen la fibrosis o disminuyen su intensidad. Éste es el caso de las prostaglandinas y de las xantinas. Al mismo nivel actúa la relaxina. Esta última es una hormona peptídica que interviene en la involución del útero y en la relajación del ligamento interpúbico. Se ha demostrado que reduce la síntesis del colágeno y del TIMP (tissue inhibitors of metalloproteinases) y que aumenta la de las colagenasas, todo ello tras elevar los valores intracelulares de AMP cíclico71.

En la degradación extracelular de MEC interviene un conjunto de proteasas que poseen una molécula de cinc en su porción activa y que se conocen como metaloproteasas (MMP)72. Son enzimas producidas por diversas células, entre las que figuran las células de Kupffer, los macrófagos y las CEH. Entre las numerosas funciones que adquieren estas células cuando se activan figura la de sintetizar y segregar MMP. Entre éstas existen proteasas que degradan a los colágenos intersticiales (I, II, III y X), son las MMP-1, MMP-8 y MMP-13. Otro grupo digiere los colágenos de las membranas (colágeno IV) y los desnaturalizados por el calor. Son las gelatinasas A y B o MMP-2 y MMP-9. Un tercer grupo lo forman las proteasas que degradan a las proteínas no colágeno de la MEC, como la fibronectina, la laminina y los proteoglicanos. A este grupo pertenecen las estromelisinas MMP-3 y MMP-10. Por último, existen MMP que forman parte integral de las membranas plasmáticas de algunas células, que probablemente tienen un papel importante en la movilidad celular73. Las colagenasas intersticiales se unen firmemente a las moléculas de colágeno fibrilar y las parten por un punto muy concreto situado próximo al extremo carboxílico. Los fragmentos resultantes de esta primera digestión pueden ser posteriormente degradados por otras proteasas y peptidadasas.

Casi todas las MMP tienen una estructura genética común74. En casi todas ellas se encuentra una organización en 10 exones, su promotor contiene una caja típica TATA, además de un elemento TRE de respuesta a los ésteres de forbol y de una región consenso para PEA-3 (polyomavirus enhancer activator)75,76. Este último parece colaborar con TRE para lograr una máxima inducción genética. A través de estos elementos actúan, estimulándola, el TNF * y las interleucinas IL-1 e IL-677. Otros factores que pueden aumentar la expresión de las MMP son la fibronectina77 y la lecitina poliinsaturada79. Por el contrario, el TGF ß 1, además de aumentar la expresión genética de las proteínas de la MEC, disminuye la de las MMP, reforzando así su poder fibrogénico80. En la proximidad del elemento consenso de AP1 en las MMP, se halla la secuencia palindrómica SBE (Smad binding element), GTCTAGAC, que probablemente reduce la unión de AP1 al promotor de las MMP e inhibe su expresión52. También el acetaldehído se comporta de forma similar, estimulando la producción de colágeno y reduciendo la expresión de las MMP47.

Un factor que desempeña un papel decisivo en la actividad de las MMP está constituido por los TIMP. Se trata de glucoproteínas de bajo peso molecular que se comportan como inhibidores específicos de las MMP. Hasta el momento se han descrito cuatro diferentes (TIMP-1 al TIMP-4)81. Aunque todos ellos pueden inhibir a todas las MMP, algunos tienen propiedades proteolíticas particulares. El más estudiado y conocido es el TIMP-1. Se trata de un importante inhibidor de las colagenasas intersticiales MMP-1 y MMP-13, de estromelisina y de la gelatinasa A (MMP-2). Aunque algunos TIMP impiden la activación de las MMP, la mayoría se unen a la región catalítica de las MMP y bloquean su acción.

En los primeros días de activación, las CEH producen MMP, pero no TIMP. Sin embargo, pasados unos días, cuando la producción de proteínas de la MEC ha aumentado de forma significativa, la producción de MMP disminuye y aumenta de forma llamativa la de TIMP82. La producción de TIMP está regulada a escala transcripcional. Sin embargo, las CEH parecen responder de forma diferente a como lo hacen los fibroblastos. Mientras que en éstos la regulación parece depender de c-Fos y de c-Jun, en las CEH activadas parece que se desarrolla con la intervención de Fra-2, FosB y JunD83. Se ha demostrado que, en el hígado de pacientes con cirrosis hepática de diferente etiología, existe un marcado aumento del TIMP-1 y del TIMP-2 y de sus correspondientes ARNm84. Lo mismo se ha comprobado en el hígado de animales con cirrosis experimental85. Entre los factores que pueden aumentar la expresión de TIMP-1 figuran las citocinas de fase aguda, en especial, las IL-1 ß y la IL-6.

APOPTOSIS DE LAS CEH

El descenso de la actividad fibrogénica en el hígado va ligado a una disminución del número de CEH. El mecanismo de esta desaparición no es bien conocido, pero cada día contamos con más pruebas de que ello se produce por la muerte de esas células por apoptosis. En estos casos, las células se retraen, su citoplasma se condensa, su membrana plasmática se ondula y su núcleo se vuelve uniforme, oscuro, picnótico e intensamente eosinofílico. Diversas observaciones demuestran que durante las fases en que se produce el descenso del número de CEH en el tejido hepático, se puede comprobar que existe un aumento de CEH que se encuentran en apoptosis85,86.

Se sabe poco sobre los mecanismos por los que se produce esa apoptosis. Los desencadenantes de este tipo de muerte celular son numerosos. En unos casos se trata de una agresión (química, radiación) que afecta al ADN. En otros, es consecuencia de la unión de determinados ligandos a sus correspondientes receptores en la superficie celular. Entre los ligandos que poseen esa actividad inductora de apoptosis figura el TNF * , la IL-1, el TGF ß y el llamado FasL (Fas ligand)87,88. Para que las CEH sean susceptibles de degeneración y muerte por apoptosis se requiere que se encuentren activadas86. Ello se debe a que estas células en fase de reposo o inactivas no expresan receptores en su superficie para esas citocinas. Durante su transformación en miofibroblastos, estas células expresan en su superficie la proteína Fas (CD95, APO-1), que pertenece a la familia de los receptores del TNF * , y que es receptora del FasL, una citocina perteneciente al grupo de los TNF89. Asimismo, esas células expresan receptores para otras citocinas o factores inductores de apoptosis. Algunos de estos factores son producidos por las propias CEH, de manera que por un mecanismo autocrino inducirían su propia muerte. Sin embargo, durante las fases de actividad inflamatoria son las células que infiltran el tejido hepático, incluidas las llamadas pit cells o natural killer hepáticas90 las principales productoras de esos factores inductores de apoptosis.

Tanto el TNF * como el FasL inducen apoptosis tras unirse a sus respectivos receptores celulares. Cuando ello se produce, atraen a la membrana a la proteína adaptadora TRADD (TNF receptor associated death domain), la cual permite la unión a ella de las proteínas FADD (Fas associated death domain)87,91, RIP y TRAF-2. Mientras que estas últimas están implicadas en la activación de IKK, en la traslocación nuclear de NF * B y en la protección de las células frente a su muerte por apoptosis92, FADD es un mediador de esta última al poner en marcha la cascada de las caspasas. Éstas son enzimas que separan un fragmento de otras proteínas, incluidas otras caspasas, partiéndolas por un punto muy concreto que tiene un ácido aspártico en su lado N-terminal93. Este corte se sigue en muchas ocasiones de la activación de la proenzima latente sobre la que ha actuado. Algunas caspasas se sitúan en la membrana plasmática (caspasas 2, 8 y 10) y son sensibles a la ocupación de los receptores celulares por sus correspondientes ligandos. Otros están en el citoplasma y tienen un papel más directo en la muerte celular. A este último grupo pertenecen las caspasas 3, 4, 6, 7 y 9. Las caspasas 3, 7 y 9 son capaces de actuar sobre la PARP (poly[adenine-diphosphate-ribosyl]polymerase) y la DAPK (DNA-activated protein kinase), que participan en la reparación del ADN, o sobre otras proteínas nucleares, como las histonas, nucleolinas y la CAD (caspase-activated DNAase)94. Esta última fragmenta la cromatina en puntos muy concretos de la hélice de ADN, lo que da lugar a fragmentos de ADN de unos 200 pares de bases o múltiplos de 200. Sustratos de la caspasa 6 son las laminas, que son proteínas nucleares que se sitúan entre la membrana nuclear y la cromatina y de las que depende la integridad nuclear95.

En los últimos años se ha conocido que entre las caspasas situadas en la membrana celular y las presentes en el interior de las células se sitúan las mitocondrias, que desempeñan un papel decisivo y condicionando que los impulsos procedentes del exterior se traduzcan o no en muerte celular96. La activación del segundo grupo de caspasas depende en parte de la presencia en el citoplasma celular del citocromo c97 (fig. 5). Éste normalmente se sitúa en el espacio intermembranoso de la pared mitocondrial formando parte de la cadena respiratoria, transportando electrones desde el complejo III al IV. Los estímulos celulares transmitidos por las caspasas de la membrana originados por la lesión del ADN determinarían la permeabilización de la membrana mitocondrial externa y la salida del citocromo c al citoplasma. Sin embargo, la eficacia de esa permeabilización está regulada por una serie de proteínas de la familia Bcl-2 que lo controla. Estas proteínas se sitúan en la membrana mitocondrial externa, formando homo o heterodímeros y controlan su permeabilidad. Hay algunas de ellas que impiden la salida del citocromo c y se comportan como antiapoptóticas. A este grupo pertenecen la Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-W, Mcl-1. Otras permiten el paso del citocromo c y actúan como favorecedores de la apoptosis. En este grupo se incluye la Bcl-Xs, Bax, Bad, Bak, NbK y Bik-1. Como los miembros apoptóticos de la familia Bcl pueden formar heterodímeros con los apoptóticos, la permeabilidad de la membrana mitocondrial para el paso del citocromo c depende del cociente entre ambos grupos de proteínas existentes en la membrana mitocondrial96,98,99.

Una vez que el citocromo c se encuentra en el citoplasma, se une a las proteínas Apaf 1 (apoptotic protease activating factor-1) para activar a la caspasa 9 o Apaf-3. Como se muestra en la figura 6, tanto la Apaf-1 como la Apaf-3 poseen una porción homóloga, denominada CARD, que permite el acoplamiento de una con otra96. Cuando esto se produce, se activa la caspasa 9, la cual a su vez activa a la caspasa 3, con las consecuencias antes apuntadas88,96.

 

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