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Análisis molecular del gen RPE65 en 72 familias españolas con retinitis pigmentaria autosómica recesiva

Molecular analysis of the RPE65 gene in 72 spanish families with autosomal recessive retinitis pigmentosa

I Marcos a, A Ruiz a, S Borrego a, C Ayuso b, Montserrat Baiget c, Guillermo Antiñolo a

a Unidad de Genética Médica y Diagnóstico Prenatal. Hospital Universitario Virgen del Rocío. Sevilla.
b Servicio de Genética. Fundación Jiménez Díaz. Madrid.
c Servicio de Genética. Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Barcelona.

Palabras Clave

RPAR. Retinitis pigmentaria. RP20. RPE65.

Keywords

arRP. Retinitis pigmentosa. RP20. RPE65.

Resumen

Fundamento: La retinitis pigmentaria autosómica recesiva (RPAR) es la forma más común de retinitis pigmentaria y se caracteriza por una gran heterogeneidad tanto alélica como génica. Previamente, se ha determinado que el gen RPE65 está implicado en el 2% de los casos de RPAR y en el 16% de los casos de amaurosis congénita de Leber. Aunque la función de RPE65 no se conoce aún, se sabe que está involucrado en el metabolismo de la vitamina A y en la regeneración de la rodopsina.

Pacientes y método: Análisis molecular indirecto del gen RPE65 en 72 familias españolas con RPAR y posterior análisis mutacional.

Resultados: El análisis molecular indirecto con el marcador microsatélite intragénico, D1S2803, nos permitió excluir el gen RPE65 en el 80,5% de las familias estudiadas. En el análisis molecular directo del gen, hemos identificado 3 nuevas variantes, IVS6-43delA, IVS6-42delT e IVS6-33C*G; IVS6-33C*G es un polimorfismo común. Los otros cambios, IVS6-43delA e IVS6-42delT, no se han encontrado en los 150 cromosomas normales estudiados. El análisis de segregación del cambio IVS6-42delT parece excluir su implicación en RP.

Conclusiones: Nuestros resultados argumentan en contra de la implicación del gen RPE65 en las familias estudiadas, indicando que la frecuencia de alteraciones en este gen en las familias RPAR españolas podría ser algo inferior a la observada en otras poblaciones estudiadas.

Abstract

Backgroud: Autosomal recessive retinitis pigmentosa (arRP) is the most common form of retinitis pigmentosa (RP). It is characterized by a high degree of allelic and non-allelic genetic heterogeneity. Previously, it has been demonstrated that the RPE65 gene is responsible for 2% recessive or isolated RP cases and 16% Leber's congenite amaurosis cases. Although the concrete function of RPE65 is unknown as yet, it has been found to be involved in vitamin A metabolism and rhodopsin regeneration.

Patients and method: We studied the involvement of the RPE65 gene in 72 arRP Spanish families by means of indirect molecular and mutation analysis.

Results: The results obtained using the intragenic microsatellite marker D1S2803 allowed us to exclude RPE65 as the causative gene of the disease in 80.5% of the families studied. Three new variants of the RPE65 gene have been identified: IVS6-43delA, IVS6-42delT and IVS6-33CG. We found that IVS6-33C*G was a common polymorphism. The other variants, namely IVS6-43delA and IVS6-42delT, were not identified in 150 control chromosomes studied. The segregation analysis of IVS6-42delT variant seemed to exclude it as being involved in the disease.

Conclusions: Our results argue against the involvement of RPE65 gene in the families studied, indicating that the prevalence of RPE65 abnormalities in arRP Spanish families may be lower than that observed in other populations.

Artículo

Recibido el 14-9-2000; aceptado para su publicación el 9-1-2001

La retinitis pigmentaria (RP) es la distrofia retiniana más frecuente. Sus características clínicas son ceguera nocturna y estrechamiento del campo visual. De forma usual, el fondo de ojo presenta movilización pigmentaria en forma de espícula ósea, palidez cérea del disco óptico y notable atenuación de los vasos sanguíneos. En aquellos pacientes con RP típica, el electrorretinograma está notablemente disminuido o incluso abolido1.

Desde el punto de vista genético la RP presenta una gran heterogeneidad tanto alélica como génica2-4 (RET-GEN-NET, http://www.sph.uth.tm.edu/RetNet/home.htm).

El locus RP20/RPE65 está implicado en el 2% de los casos de RP autosómica recesiva (RPAR) y en el 16% de los casos de amaurosis congénita de Leber5-7. El gen RPE65, localizado en 1p31, contiene 14 exones y codifica un transcrito de 2,7 kb expresado específicamente en el epitelio pigmentario de la retina8. Esta proteína de 61 kDa está involucrada en el proceso de reciclaje de los retinoides, elementos esenciales para el correcto funcionamiento del proceso de fototransducción, y en la regeneración de la rodopsina. RPE65 parece actuar en el proceso de isomerización del todo-trans-retinil éster al 11-cis-retinol, y se ha observado que animales deficientes en esta proteína tienen interrumpido este paso de isomerización y desarrollan degeneración retiniana con deterioro grave de la función de los bastones9,10.

En este artículo presentamos la evaluación de la implicación de alteraciones del gen RPE65 en el desarrollo de RPAR en una cohorte de 72 familias españolas con RPAR típica.

Pacientes y método

Pacientes

En este estudio se ha incluido a 72 familias españolas con RPAR, 38 de las cuales son consanguíneas, procedentes de distintas comunidades autónomas. En este grupo se encuentran familias diagnosticadas entre 1990 y 1999 por especialistas del Hospital Universitario Virgen del Rocío, la Fundación Jiménez Díaz y el Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Todos los pacientes tienen síntomas típicos de RP, fondo de ojo característico y electrorretinograma escotópico abolido. La herencia autosómica recesiva se confirmó por la presencia de dos o más personas afectadas en la familia, o bien presencia de consanguinidad, y por la ausencia de cualquier signo o síntoma en los padres de los pacientes.

Análisis molecular

La extracción de ADN genómico se llevó a cabo a partir de sangre periférica11. Los marcadores microsatélites se genotiparon individualmente mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando condiciones previamente publicadas12. Los cebadores utilizados para la amplificación de los marcadores seleccionados se obtuvieron de las bases de datos públicas.

Para llevar a cabo el análisis molecular indirecto del gen RPE65 en las familias incluidas en este estudio, seleccionamos inicialmente un microsatélite intragénico localizado en la región 5'-no traducido del gen D1S28035. Tras este análisis se excluyeron aquellas familias consanguíneas en las que los afectados eran heterocigotos para el marcador intragénico analizado y las familias no consanguíneas en las que los marcadores microsatélites no segregaban con la enfermedad. Las familias que resultaron semiinformativas o no informativas se revaluaron con tres marcadores flanqueantes al locus RPE65, D1S2806, D1S2829 y D1S219 (D1S2806-0,1 cM-D1S2803/RPE65-0,0 cM-D1S2829-0,1 cM-D1S219). La información de cada marcador se obtuvo de las bases de datos públicas de Généthon y Genome Database (GDB).

Las muestras de ADN de cada uno de los pacientes índice de las familias que cumplían los criterios de inclusión se amplificaron por PCR, utilizando parejas de cebadores intrónicos flanqueantes de la secuencia exónica6. Los productos de PCR fueron analizados mediante secuenciación directa y análisis conformacional de cadena sencilla fluorescente (F-SSCP) usando condiciones modificadas de las previamente publicadas13.

Los polimorfismos identificados fueron analizados mediante transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) usando sondas específicas y el sistema LightcyclerTM (Roche, Rahway, NI).

Todas las reacciones de PCR se llevaron a cabo a volumen final 10 µ l usando 25 ng de ADN genómico, 1X LightCycler-DNA Master Hybridization Probes, 2,5 µ m de Cl2MG, 1 µ m de cada cebador (TIBMolbiol) y 0,5 µ m de cada sonda (TIBMolbiol) (fig. 1). Las condiciones de amplificación fueron una desnaturalización inicial de 95 °C durante 2 min seguida de 45 ciclos de 95 °C durante 0 s, 63 °C durante 15 s, y 72 °C durante 15 s. Posteriormente, las muestras se sometieron a una rampa de 40 a 90 °C con monitorización continua de la fluorescencia (f2/f1).

Fig. 1. Representación de la secuencia de los cebadores y las sondas empleadas en el estudio.

Resultados y discusión

El gen RPE65 ha sido evaluado en 72 familias españolas con RPAR típica mediante mapeo de homocigosis y estudio de segregación. El análisis molecular indirecto del gen, usando el marcador intragénico D1S2803, ha permitido excluir al 80,5% de las familias RPAR incluidas en este estudio (58/72), mientras que el 5,5% (4/72) presentó un estudio de segregación positivo. El 13,8% de las familias (10/72) fue revaluado con los tres marcadores flanqueantes al marcador microsatélite intragénico del gen RPE65, referidos en la sección de pacientes y métodos. Utilizando la información obtenida del total de los marcadores microsatélites seleccionados ha sido posible excluir el gen RPE65 en el 90,2% de las familias analizadas, de forma que sólo en el 9,8% de las familias RPAR típicas fue necesario el análisis molecular directo del gen RPE65.

El análisis molecular directo de la secuencia codificante y los extremos 5' y 3' de los intrones del gen RPE65 en los pacientes índice de las 7 familias incluidas ha permitido identificar dos cambios, IVS6-33C-G e IVS6-42delT, con respecto a la secuencia previamente publicada (U20476). Se ha hallado IVS6-33C * G, una transversion C-G en la posición ­33 del exón 7, identificada en heterocigosis en cuatro de los 7 pacientes estudiados, que se ha encontrado en la población general con una frecuencia de 0,42.

La variable IVS-42delT corresponde a una deleción de una timina en la posición ­42 del exón 7, identificada en homocigosis en el paciente RP66.II-3 y en heterocigosis en el paciente RP66.II-7 (fig. 2). Aunque no se ha identificado en 150 cromosomas normales estudiados, el estudio de segregación de esta mutación en la familia RP66 la descarta como causante de la enfermedad.

Fig. 2. Análisis de segregación del cambio IVS6-42delT en la familia RPAR RP66.

Para determinar la frecuencia de este cambio en pacientes con RP, estudiamos este cambio en 75 pacientes esporádicos de RP mediante FRET, usando sondas específicas y el sistema LightcyclerTM (Roche Diagnostics). Este sistema permite analizar no sólo el cambio puntual sino también la secuencia complementaria a la sonda sensor (T delet), ya que cualquier cambio en la sonda T delet (fig. 1) dará lugar a una temperatura de fusión más baja que la del alelo normal (fig. 3). La variante IVS6-42delT no se encontró en ninguno de los 150 cromosomas estudiados. Sin embargo, identificamos un cambio muy cercano a éste, IVS6-43delA, en heterocigosis en uno de los pacientes esporádicos con RP. Dicha variante tampoco se identificó en ninguno de los 150 cromosomas normales estudiados. En este caso, debido a las características del árbol familiar, no hemos podido realizar el estudio de segregación.

Fig. 3. Análisis de las curvas de fusión de los cambios IVS-42delT e IVS6-43delA.

Los datos obtenidos del análisis molecular del gen RPE65 indicarían que la frecuencia de alteraciones en este gen en nuestras familias RPAR es similar o algo inferior a la observada en otras poblaciones estudiadas hasta ahora7. Así mismo, los resultados indicarían que las mutaciones IVS6-42delT y IVS6-43delA son variantes no patogénicas.

Sin embargo, es interesante destacar que dichos cambios no están presentes en ninguno de los 150 cromosomas controles. Por otra parte, están localizados en un tracto de poliadeninas que, al igual que otras secuencias repetitivas, es altamente mutable. La causa podría estar en que el deslizamiento (slippage) durante el proceso de replicación da lugar a deleciones más que a inserciones. Es posible que esta secuencia, de forma aislada o en conjunción con secuencias cercanas, sea inestable y tienda a generar mutaciones somáticas en sus alrededores14. Además, los cambios están localizados dentro del sitio de ramificación del intrón 6, por lo que pueden originar un proceso defectuoso de maduración del ARNm15.

En cualquier caso, son necesarios otros estudios, entre ellos el análisis de expresión génica, para determinar si existe relación de estas variantes con el desarrollo de la RP.

Agradecimientos

Queremos expresar nuestra gratitud a todo el colectivo de pacientes con retinitis pigmentaria por su colaboración, esencial para el desarrollo de nuestro trabajo. Este estudio ha sido financiado en parte por el Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS 99/0010-02), la Fundación ONCE, la Consejería de Salud/Comunidad Autónoma de Andalucía (98/144) y la Asociación Andaluza de Retinosis Pigmentaria. Irene Marcos recibe una beca del Instituto de Salud Carlos III (99/4250), Ministerio de Sanidad y Consumo.

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