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Diagnóstico de teniasis humanas mediante PCR-multiplex

Diagnosis of human taeniasis by multiplex-PCR

Estrella Montero a, Luis M González a, Sabino Puente b, Teresa Gárate a

a Instituto de Salud Carlos III. Centro Nacional de Microbiología. Majadahonda. Madrid.
b Hospital Carlos III. Madrid. España.

Artículo

Sr. Editor: Los dos grandes ténidos del ser humano con mayor importancia médica son Taenia solium y Taenia saginata. Ambas especies causan la teniasis intestinal, a su vez el cisticerco de T. solium es la causa de la cisticercosis humana, cuya complicación más grave es la neurocisticercosis, en ocasiones mortal1. Cabe destacar que en los últimos años se ha producido un aumento del número de casos de teniasis y cisticercosis en zonas endémicas y no endémicas debido a las variaciones producidas en factores demográficos, técnicos y políticos2. En relación con España, se detecta teniasis con cierta frecuencia3,4 y se aprecia un incremento en los casos de cisticercosis en viajeros y población inmigrante5. A pesar de su interés, no existen estimaciones reales sobre la verdadera incidencia de la teniasis, siendo evidente la importancia que supondría el desarrollo de un diagnóstico diferencial específico y sensible para detectar a los portadores de ténidos, en especial los de T. solium, e interrumpir la transmisión de las cisticercosis. Con respecto a la teniasis, los métodos de diagnóstico actuales presentan importantes limitaciones, tales como la escasa especificidad y pobre sensibilidad6,7. Preocupados por este tema, realizamos un trabajo cuyo objetivo fue demostrar la utilidad de la multiplex-HDP2-PCR8,9 como posible técnica habitual en el diagnóstico diferencial de teniasis.

Así, durante el bienio 2000-2001 en el Servicio de Parasitología del Centro Nacional de Microbiología se procesaron 14 proglótides grávidas expulsadas por pacientes, con historia y origen geográfico diverso, utilizando métodos coprológicos y multiplex-PCR. Mientras que 11 proglótides fueron susceptibles de identificación morfológica mediante tinción con «tinta china» y posterior recuento de sus ramas uterinas6, las muestras restantes no pudieron ser estudiadas debido al estado de descomposición en que se encontraban. Tras el examen morfológico se llevó a cabo la extracción del ADN genómico (ADNg) con un tampón de lisis con tiocianato de guanidinio10, a partir de aproximadamente 1 mg de cada proglótide, incluidas las muestras deterioradas. Posteriormente los ADNg fueron precipitados con isopropanol y disueltos en 10 µ l de agua. Como controles positivos se utilizó ADNg purificado de T. saginata y T. solium, cedidos por la Dra. Leslie Harrison (CTVM, Escocia) y la Dra. Edda Sciutto (UNAM, México), respectivamente. Los ADN extraídos, así como los controles positivos y control negativo (sin ADN), se utilizaron en la reacción de amplificación multiplex-HDP2-PCR8,9. Los productos amplificados se separaron en geles de agarosa al 2%, con bromuro de etidio, y se visualizaron con luz ultravioleta.

El examen morfológico de las proglótides reveló que 11 de las 14 muestras eran T. saginata, mientras que las otras tres no pudieron ser identificadas dado el mal estado de las proglótides, completamente maceradas o fragmentadas. Asimismo el diagnóstico mediante multiplex-HDP2-PCR, en el que se utilizó los ADNg extraídos de las 14 muestras, puso de manifiesto que todas las muestras correspondían a T. saginata. En la figura 1 se observa la amplificación de una selección de las muestras problema, entre las que se incluyen las proglótides en mal estado. En todos los casos se observaron dos bandas de amplificación de 600 y 170 pb, respectivamente, al igual que el control positivo de ADNg de T. saginata y a diferencia de T. solium, que rindió un fragmento de 170 pb. Por consiguiente, mediante multiplex-HDP2-PCR se confirmó el resultado del examen morfológico y se diagnosticaron las proglótides en mal estado que no habían sido susceptibles de identificación morfológica.

Fig. 1. Electroforesis en gel de agarosa al 2%, con bromuro de etidio, de los productos de amplificación obtenidos mediante multiplex-HDP2-PCR a partir de ADNg extraído de proglótides eliminadas por pacientes con teniasis: proglótides en buen estado de conservación (1-3); proglótides en mal estado de conservación (4 y 5); controles positivos: 10 ng ADNg de Taenia saginata, (6), 10 ng ADNg de T. solium (7) y control negativo (8). Marcador de peso molecular (M).

En conclusión, este trabajo demuestra la utilidad de la técnica multiplex-HDP2-PCR como un método de diagnóstico habitual, rápido, sencillo, sensible y específico, capaz de identificar diferencialmente teniasis producidas por T. saginata y T. solium en pacientes que acuden a los distintos centros sanitarios con el problema, siendo la técnica imprescindible cuando las proglótides se encuentran deterioradas. Además, el hecho de que en estudios preliminares se haya aislado ADNg a partir de huevos de Taenia spp., eliminados en las heces de enfermos, aumenta la relevancia del protocolo de PCR propuesto, ya que permitirá el diagnóstico especie-específico de esta fase parasitaria, frecuentemente aislada en los estudios coprológicos e imposible de identificar su especie por los métodos convencionales.

Agradecimientos

Este trabajo ha sido financiado por EU-INCO (IC 18 CT 950002) y FIS (97/0141; 00/0407). Los autores quieren agradecer a los Dres. Teresa Serra (Servicio de Microbiología. Hospital Son Dureta. Palma de Mallorca) y José Luis Díaz de Tuesta (Servicio de Microbiología. Hospital de Mendaro. Mendaro) el suministro de parte de las muestras clínicas examinadas. También desean reconocer la labor constante de los Dres. Michael Parkhouse y Leslie Harrison, organizadores del grupo internacional de cisticercosis al que pertenecen. Estrella Montero y Luis M. González tienen una beca predoctoral y posdoctoral del Instituto de Salud Carlos III, respectivamente.

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