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SCImago Journal & Country Rank
doi: 10.1016/j.medcli.2010.09.008

Inmunodiagnóstico y biomarcadores en tuberculosis

Immunodiagnosis and biomarkers in tuberculosis

Heinner Guio ab, , Cristina Vilaplana cd, Pere-Joan Cardona dc

a Center for Molecular Microbiology and Infection and Division of Medicine, Imperial College London, United Kingdom
b ALBIOTEC - Asociación Latinoamericana de Biotecnología, Lima, Perú
c Unitat de Tuberculosi Experimental, Department of Microbiology, Fundació Institut per a la Investigació en Ciències de la Salut Germans Trias i Pujol, Universitat Autònoma de Barcelona, Badalona, España
d CIBER Enfermedades Respiratorias, Instituto Carlos III, Palma de Mallorca, España

Palabras Clave

Tuberculosis. Diagnóstico. Inmunología. Biomarcadores.

Keywords

Tuberculosis. Diagnosis. Immunology. Biomarkers.

Resumen

Basándose en el test cutáneo de la tuberculina se estima que un tercio de la población mundial tiene una infección tuberculosa latente. Las nuevas estrategias en salud pública e investigación están dirigidas a disminuir y erradicar este enorme reservorio. Sin embargo, la ausencia de biomarcadores para el diagnóstico y tratamiento de la tuberculosis latente limita el desarrollo de nuevos fármacos y vacunas. Algunos componentes están presentes tanto en la proteína purificada derivada de Mycobacterium tuberculosis (PPD) (usada en el test cutáneo de la tuberculina) como en la vacuna BCG, lo cual incrementa el número de falsos positivos en personas vacunadas. Al día de hoy, ningún método inmunológico existente puede diferenciar la tuberculosis latente de la tuberculosis activa. Estudios recientes han abordado estrategias incluyendo anticuerpos específicos, nuevas citocinas y/o antígenos como candidatos a biomarcadores. Sin embargo, los altos costos de estos estudios, el bajo número de participantes y su diferente metodología dificultan la posibilidad de realizar un futuro metanálisis y hacen que todavía no se tengan resultados concluyentes.

Abstract

Based on the tuberculin skin test it is estimated that latent tuberculosis infection is present in one-third of the world's population. The new strategies in public health and research are aimed to reduce and eradicate this enormous reservoir. However, the absence of effective biomarkers for diagnosis and treatment of latent tuberculosis limits the development of new drugs and vaccines. Some components are present in both, the PPD (used in the tuberculin skin test) and the BCG vaccine. This increases the number of false positives in vaccinated individuals. Nowadays, there is not an immune diagnostic method that can differentiate latent tuberculosis and tuberculosis disease. New studies have addressed some strategies including specific antibodies, new cytokines and / or antigens as candidates for biomarkers. However, the high costs of these studies, the low number of participants and their different methodology make difficult a future meta-analysis and more conclusive results.

Artículo

Introducción

La organización mundial de la salud estima que anualmente existen 9,2 millones de casos incidentes de tuberculosis, con más de 2 millones de muertes1. Basándose en el test cutáneo de la tuberculina (TCT), se calcula que un tercio de la población mundial tiene una infección tuberculosa latente (ITBL), no existiendo manifestaciones clínicas, bacteriológicas ni radiológicas que evidencien la infección2. Durante este estadio, el Mycobacterium tuberculosis (Mtb) tiene un metabolismo bajo y expresa antígenos diferentes a los que expresa cuando muestra un metabolismo alto (durante la tuberculosis activa). La mayoría de los fármacos antituberculosos, incluyendo la isoniazida (comúnmente usada quimioprofilaxis de la ITBL), han sido evaluadas experimentalmente en condiciones donde el Mtb tiene un metabolismo alto.

Incluso en países con baja incidencia de tuberculosis, la dificultad en el diagnóstico inicial está incrementando la proporción de tuberculosis en estadios avanzados3. Aunque los esquemas de tratamiento han sido exitosos en muchos países, todavía existen algunas limitaciones: 1) la duración y complejidad del esquema terapéutico lleva a incrementar los fallos del tratamiento y las recaídas, además de los graves efectos adversos, los cuales contribuyen a la no adherencia al tratamiento; 2) la resistencia a los fármacos; 3) la coinfección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH); y 4) la quimioprofilaxis en tuberculosis latente4. Los recientes estudios de investigación están considerando mejorar la efectividad de los fármacos y vacunas o la combinación de ambos para disminuir el período de tratamiento en tuberculosis activa y latente5, 6, 7. En estos estudios los biomarcadores cumplen un papel muy importante tanto en la práctica clínica para modificar el tiempo y/o esquema de tratamiento como en los estudios clínicos con el fin de evaluar un nuevo fármaco o vacuna.

Biomarcadores en tuberculosis

Los biomarcadores son, por definición, mediciones e indicadores de un sistema biológico, de un proceso patogénico o de uno farmacológico en respuesta a una intervención terapéutica. En la tuberculosis activa, los biomarcadores deberían usarse en el momento del diagnóstico y para evaluar la respuesta al tratamiento (temprana y al final) y el período de seguimiento (postratamiento, para detectar las recaídas) (Figura 1). A día de hoy, la evaluación clínica y la radiografía de tórax son las más usadas para la evaluación del paciente, mientras que las baciloscopias y la conversión del cultivo de esputo a los dos meses son marcadores para evaluar la carga bacteriana y la efectividad del tratamiento.

Períodos de tiempo para evaluar un biomarcador en tuberculosis activa. Las muestras tomadas durante los dos primeros meses de terapia serían para evaluar la respuesta temprana y modificar el tiempo de tratamiento.

Figura 1. Períodos de tiempo para evaluar un biomarcador en tuberculosis activa. Las muestras tomadas durante los dos primeros meses de terapia serían para evaluar la respuesta temprana y modificar el tiempo de tratamiento.

En algunos sistemas de salud, el TCT aún se usa en el diagnóstico de tuberculosis y de ITBL. Sin embargo, no existe ningún biomarcador para evaluar la efectividad de la isoniazida u otro fármaco nuevo durante la quimioprofilaxis. La actual definición de ITBL incluye diversos estadios de infección, incluyendo al paciente que mantiene al Mtb en estadios de nula y/o baja replicación, lo que explicaría la continua producción de interferón gamma (INF-γ) en pacientes con ITBL8. Las nuevas estrategias para el desarrollo de biomarcadores y nuevos fármacos proponen definir la infección por tuberculosis como un “spectrum” que abarca desde la eliminación del bacilo de forma inespecífica a la infección latente y a su progresión a enfermedad activa (Figura 2). Este modelo ayudaría a diseñar mejores estrategias durante el descubrimiento de nuevos fármacos y a dirigir el tratamiento hacia los individuos que tienen alto riesgo de progresión a enfermedad en lugar de dar tratamiento a los dos billones de individuos TCT positivos9. Se sabe que la isoniazida actúa en la inhibición de la biosíntesis de los ácidos micólicos, producidos cuando Mtb tiene un metabolismo alto. Sin embargo, Mtb cambia su actividad metabólica en las lesiones granulomatosas, con lo que la isoniazida sólo tendría efecto en los períodos de replicación del Mtb (explicando la disminución de reactivación de 75 a 65% si tratamos la ITBL durante un año en lugar de 6 meses10, concepto contrario a la hipótesis clásica para explicar la patogenia de la ITBL y a favor de la hipótesis dinámica recientemente postulada11.

Infección por tuberculosis vista como un “spectrum”. La definición actual de infección tuberculosa latente engloba individuos que presentan una respuesta inmunológica de memoria con y sin persistencia del <i>Mycobacterium tuberculosis</i>. Este modelo menciona todas las posibles respuestas a la micobacteria, y los estadios de infecion que debiera ser identificados por un biomarcador.

Figura 2. Infección por tuberculosis vista como un “spectrum”. La definición actual de infección tuberculosa latente engloba individuos que presentan una respuesta inmunológica de memoria con y sin persistencia del Mycobacterium tuberculosis. Este modelo menciona todas las posibles respuestas a la micobacteria, y los estadios de infecion que debiera ser identificados por un biomarcador.

Los estudios de biomarcadores durante la quimioprofilaxis de la ITBL deberían considerar las condiciones basales antes de la quimioprofilaxis, además de evaluar la respuesta al tratamiento (incluyendo la respuesta temprana) y un período prudente de seguimiento (Figura 3). Actualmente, la mayoría de los estudios en ITBL están evaluando la utilidad de nuevos antígenos de Mtb para ser usados como marcadores: antígenos expresados en condiciones de hipoxia, similares a la de latencia del Mtb en el granuloma y donde existe una ausencia o baja replicación de la bacteria, debido a la respuesta inmune del individuo12, 13, 14.

Períodos de tiempo para evaluar un biomarcador en infección tuberculosa latente. Los nuevos fármacos deben de estar orientados a disminuir el período de profilaxis; un buen indicador de la reducción de este tiempo es la evaluación de la respuesta temprana a los dos meses de tratamiento. Un control basal preprofilaxis ayudaría a evaluar las concentraciones basales del biomarcador y un control postprofilaxis ayudaría a validar el tratamiento.

Figura 3. Períodos de tiempo para evaluar un biomarcador en infección tuberculosa latente. Los nuevos fármacos deben de estar orientados a disminuir el período de profilaxis; un buen indicador de la reducción de este tiempo es la evaluación de la respuesta temprana a los dos meses de tratamiento. Un control basal preprofilaxis ayudaría a evaluar las concentraciones basales del biomarcador y un control postprofilaxis ayudaría a validar el tratamiento.

Inmunodiagnóstico en tuberculosis Test cutáneo de la tuberculina

El TCT, que usa proteína purificada derivada de Mtb (PPD) es uno de los primeros biomarcadores existentes, que ha sido usado durante casi 100 años para el diagnóstico de TB activa y para predecir la reactivación de la ITBL en diferentes poblaciones. Un TCT positivo indica infección, sin ser capaz de diferenciar enfermedad activa. La conversión de un TCT negativo a un TCT positivo tiene mucho valor diagnóstico para iniciar la terapia preventiva de los contactos. Sin embargo, un TCT negativo no excluye infección, desventaja importante en niños y pacientes con desnutrición, infección por el VIH u otra inmunodepresión, quienes tienen tasas más altas de falsos positivos y que de estar infectados rápidamente progresan a una infección diseminada.

Para el diagnóstico de tuberculosis activa, y adicionalmente al TCT, se deberá evaluar la clínica del paciente y el historial de contactos.

La principal limitación del TCT es que se ve influenciado por la vacunación con el bacilo de Calmette Guerin (BCG), la cual incrementa el numero de falsos positivos; esto es debido a que cerca de 200 antígenos contenidos en el PPD que se usa para el TCT están presentes en la vacuna BCG15. Otra de las limitaciones es el efecto “Boosting”, definido como el incremento de la reacción de un TCT después una segunda inoculación de PPD. Sin embargo, este efecto también ha sido descrito para los métodos inmunológicos que usan la medición de IFN-γ secretado específicamente como diagnóstico de infección tuberculosa (TIGRAS, por T-cell Interferon gamma release assay), en que la respuesta medida se vería incrementada falsamente si es medida más allá de los 3 días de la realización de un TCT16.

TIGRAS

Dos métodos inmunológicos que miden la respuesta específica de antígeno mediante la producción de INF-γ y creados a mediados de los años 1990 se encuentran disponibles comercialmente. El QuantiFERON-TB Gold se basa en el método de enzimoinmunoanálisis, y mide el INF-γ secretado de forma antígeno-específica por parte de las células T circulantes contenidas en un mililitro de sangre total. El T-Spot.TB, por otro lado, se basa en la técnica de ELISPOT para cuantificar el número de células productoras de INF-γ a partir de un total de 2,5×105 de células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por Peripheral Blood Mononuclear Cells). Ambos métodos usan los antígenos ESAT-6 y CFP-10 (además de TB7.7 en el caso del QuantiFeron-TB Gold), todos específicos del grupo Mycobacterium tuberculosis complex, los cuales se perdieron durante el proceso de atenuación de Mycobacterium bovis en la producción de la vacuna BCG. Los TIGRAS se han incluido en los algoritmos diagnósticos y se recomiendan según 3 opciones (dependiendo de la población en estudio y según los criterios de cada país): a) el TCT tendría que ser reemplazado por los TIGRAS (en los casos de terapia anti-TNF-α, en Suiza y Alemania), b) se puede usar indistintamente un TCT o los TIGRAS (EE.UU.), o c) estrategia de doble paso, consistente en un TCT seguido de la realización de un TIGRA (Reino Unido, España)17, 18, 19, 20.

En un reciente metanálisis la sensibilidad para el QuantiFERON-TB Gold fue de 78% y para el T-Spot.TB de 90%. El QuantiFERON-TB Gold mostró una especificidad del 99% entre la población no vacunada con BCG y 96% entre la población vacunada, mientras que el T-Spot.TB mostró un 93% de especificidad. La sensibilidad del TCT fue muy variable (entre 60 y 90%), aunque mostró una alta especificidad (97%) entre la población no vacunada con BCG21. Ninguno de los métodos ha demostrado poder diferenciar entre tuberculosis activa y latente17, 21, 22, si bien un reciente estudio sugiere el potencial uso de T.Spot.TB en el diagnóstico de la tuberculosis pulmonar activa, empleando linfocitos de lavado broncoalveolar y con una sensibilidad del 91% y una especificidad del 80%23.

Las ventajas del T-Spot.TB frente al QuantiFERON-TB Gold es el uso de una cantidad estándar y conocida de células viables durante el estímulo (250.000 PBMC) frente a una cantidad no determinada de linfocitos contenido en un mililitro de sangre en el caso del QuantiFERON-TB Gold. Esta ventaja del T.Spot.TB hace que disminuya el número de falsos negativos cuando se analizan muestras de individuos inmunodeprimidos, como los pacientes portadores del VIH, ya que se ve menos afectado por el número de linfocitos CD424, 25, 26. La principal ventaja del QuantiFERON-TB Gold frente al T-Spot.TB es logística, en términos de obtención, transporte y manipulación de la muestra. Debido a que es una técnica menos compleja, que no requiere mucho entrenamiento para desarrollarla, el ahorro de recursos humanos se ve reflejado en un coste menor.

Ambos métodos tienen muchas ventajas en comparación con el TCT: se necesita una sola visita del paciente y son métodos ex vivo, lo cual reduce la subjetividad, los efectos adversos y no existe efecto “boosting” cuando el test es repetido. Sin embargo, el alto coste de estos nuevos métodos es desfavorable, sobre todo en países en vías de desarrollo, donde se encuentra más del 80% de los pacientes infectados, y los dos necesitan de la obtención de sangre, lo que puede representar un problema en algunas poblaciones como la pediátrica.

Ambos métodos consideran un tiempo de cultivo de 16 a 24 horas. Un estudio reciente muestra que la cantidad de INF-γ producida en este período de tiempo correspondería al producto de las células T efectoras. En un individuo con el antecedente de infección de larga duración, el número de células T efectoras podría ser bajo, obteniendo resultados negativos cuando se considera un corto período de incubación (24 horas) y resultados positivos después de un prolongado tiempo de incubación (6-7 días), debidos teóricamente a células de memoria27. Finalmente, no sólo los antígenos y el tiempo de incubación explicarían los falsos negativos en estos dos métodos, la susceptibilidad genética que ofrecen la protección o susceptibilidad a desarrollar tuberculosis debería ser materia de estudio en los próximos años28.

Métodos serológicos

El desarrollo de métodos serológicos ha sido muy limitado debido a la creencia de que la respuesta humoral no tiene un papel importante en la protección frente al Mtb. Sin embargo, en los últimos años han surgido estudios que discrepan sobre esta teoría y apoyan una implicación mixta de las dos respuestas, celular y humoral. Los métodos serológicos miden la presencia de anticuerpos específicos, dirigida contra antígenos inmunodominantes de los patógenos. Estos métodos tienen la ventaja de ser rápidos y con resultados disponibles en horas, usando tecnología simple que podría ser adoptada incluso en centros de salud de medianos y de pocos recursos. Ya en el año 1995 Hussain et al postularon que la diferencia entre infección y enfermedad podría residir en los switch IgM-IgG29. Estudios más recientes sugieren que la respuesta humoral hacia antígenos proteicos y glucolípidos del Mtb podrían diferenciar la tuberculosis cavitaria de la no cavitaria30; y que el uso de múltiples antígenos podría facilitar el desarrollo de métodos con alta sensibilidad para el diagnóstico de Mtb31, inclusive en pacientes infectados con VIH32.

Preguntas por resolver ¿Es el INF-γ la mejor citocina a ser evaluada?

Citocinas inflamatorias como el INF-γ y el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) cumplen un rol importante en la activación de los macrófagos para la lisis del Mtb fagocitado. Además, el bloqueo o ausencia de sus receptores incrementa la susceptibilidad a la infección y el grado de facilidad para desarrollar tuberculosis activa, especialmente en pacientes con artritis reumatoide en tratamiento con bloqueadores de TNF-α33, 34. Se ha sugerido también que los pacientes con tuberculosis pulmonar cavitaria con tratamiento anti-tuberculoso suplementado con nebulizaciones de INF-γ tendrían menos carga bacilar e inflamación pulmonar, reduciendo la trasmisión del Mtb en la primera fase de tratamiento35. Si bien el IFN-γ determinado mediante enzimoinmunoanálisis y ELISPOT es el biomarcador de momento más consensuado, se están evaluando nuevas estrategias, como la combinación de métodos que miden la respuesta humoral y celular en pacientes con tuberculosis latente. Estos estudios muestran que la respuesta innata (mediada por IFN-γ) variaría de acuerdo al área endémica de tuberculosis, en contraste con la respuesta humoral (IgG), que se mantendría más estable y en bajas concentraciones en la ITBL, incluso en poblaciones endémicas, incrementando su concentración en pacientes con tuberculosis activa36.

Estudios recientes que emplean la tecnología Luminex (que cuantifica hasta 42 citocinas usando 25μl de diferentes fluidos y sobrenadantes de cultivo) está permitiendo encontrar otras citocinas con respuesta comparable o mejor a la del IFN-γ, y que podrían ser usadas solas o asociadas a este. IP-10 y MCP-2 han sido propuestos como potenciales biomarcadores para el diagnóstico37, mientras que interleucina IL-10, IL-6, IP-10 y MCP-1 podrían ser potencialmente útiles en el seguimiento de pacientes con tuberculosis activa38, 39, y un reciente estudio muestra que IP-10 también podría ser un buen biomarcador para diagnóstico de ITBL en niños40. Sin embargo, se necesitan más estudios que evalúen un número mayor de población, nuevos antígenos y citocinas producidas con el fin de encontrar biomarcadores robustos para diferenciar tuberculosis activa de ITBL, y respuesta de memoria en individuos curados de la respuesta obtenida en pacientes con ITBL.

Relación entre eI IFN-γ, la edad, raza, exposición e inmunodepresión

El sistema inmune TH1, que se relaciona con la respuesta de IFN-γ, es muy inmaduro en niños. Un estudio reciente sugiere que retrasar la administración de la vacuna BCG en 10 semanas sería mas efectivo para el recién nacido41 Algunos estudios proponen disminuir el punto de corte de la positividad del QuantiFERON de 0,35 IU/mL a 0,26 IU/mL para el diagnóstico de ITBL en niños menores de 2 años42. En el caso de los pacientes geriátricos, en cambio, la sensibilidad de los TIGRAS parece verse menos afectada con el progreso de la edad en comparación con el TCT43.

Por otro lado, aspectos raciales se han asociado a diferentes enfermedades, y la evidencia en seres humanos y en animales de experimentación indica que la respuesta a las infecciones tiene una regulación genética. Estudios retrospectivos muestran un incremento en la susceptibilidad de desarrollar tuberculosis pulmonar y extrapulmonar en individuos de raza negra44, 45 y algunas hipótesis sugieren que se debería al incremento en la variabilidad de genes relacionados con la producción de oxido nítrico (vital en la función del macrófago y la formación del granuloma) con relación a los receptores de INF-γ46.

El grado de exposición y/o contacto con el caso índice se ha relacionado con las respuestas a IFN-γ; por consiguiente este parámetro debería tomarse en cuenta durante los estudios de profilaxis en tuberculosis latente para que una baja efectividad del tratamiento no se vea confundida por la continua exposición bacteriana al caso índice47, 48. Finalmente, un estudio realizado en España muestra un 15,43% de positividad a la prueba de IFN-γ (QuantiFERON) en pacientes con alto riesgo de reactivación tuberculosa, encontrándose un 30,23% en los pacientes con diálisis49

La mejor muestra para medir un biomarcador

La detección del Mtb en esputo tiene bajo rendimiento y requiere la experiencia de un buen microscopista, en situaciones como la tuberculosis paucibacilar (observada con frecuencia en población pediátrica), la tuberculosis extrapulmonar o la coinfección por VIH, el diagnóstico todavía se hace más complicado. Por consiguiente, la muestra ideal sería: 1) de fácil colección y transporte; 2) de procesamiento práctico y 3) de bajo coste. La información contenida en una muestra de sangre es muy amplia. El aislamiento y la preservación de las células para ser analizadas con métodos como ELISPOT hace que sea una muestra poco práctica de manipular, mientras que el suero y el plasma son más prácticos para trabajar (ya que se usa la técnica de enzimoinmunoanálisis), aunque los costes siguen siendo elevados, de difícil aplicación en países con recursos limitados. La orina es una muestra de fácil recolección con métodos no invasivos e ideal para población pediátrica y pacientes que no producen un esputo adecuado, por lo que cada vez está siendo más investigada. Actualmente de una muestra de orina se pueden recuperar los fragmentos del ADN del Mtb50, así como cuantificar componentes de la pared celular de la micobacteria, como el lipoarabinomanano (LAM). La medición de este último componente y su correlación con la carga bacteriana en esputo se ha sugerido como un posible buen indicador de respuesta temprana al tratamiento51, 52.

Conclusiones

La erradicación de la tuberculosis necesita de la existencia de biomarcadores que puedan correlacionarse robustamente con la presencia de infección, de enfermedad activa y de respuesta al tratamiento indicado. A día de hoy, no existe ningún biomarcador ideal, y se dedican muchos recursos de investigación para encontrarlos. Las muestras para evaluar un nuevo biomarcador deberían ser de fácil obtención, transporte y procesamiento, como orina o productos sanguíneos (sangre total, suero, plasma). Actualmente, las técnicas disponibles son de dificultad variable y aún de costes altos, y el TCT está sujeto a un alto número de falsos positivos y falsos negativos. Si bien por ahora la secreción específica de IFN-γ es el biomarcador más desarrollado de los últimos años, se están evaluando nuevos antígenos diana, otras citocinas y tiempos de cultivo de la muestra, con el fin de encontrar qué se correlacionaría mejor con la ITBL y con enfermedad activa, así como con la respuesta al tratamiento. Sin embargo, y desgraciadamente, los altos costes de estos estudios, el bajo número de participantes y la falta de criterios para estandarizar sus métodos están retrasando la obtención de resultados concluyentes, con lo que en un futuro próximo serán imprescindibles estudios nuevos y más amplios.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

El autor expresa su agradecimiento a los miembros del proyecto Grand Challenges in Global Health- “Drugs for Treatment of Latent Tuberculosis”, patrocinado por la fundación Bill y Melinda Gates.

Recibido 20 Mayo 2010
Aceptado 7 Septiembre 2010

Autor para correspondencia. hguio@imperial.ac.uk

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