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Resistencia genotípica a sulfamidas en pacientes con neumonía por Pneumocystis jiroveci

Genotypic resistance to sulfamide drugs among patients with Pneumocystis jiroveci pneumonia

Enrique Calderón a, Carmen de la Horra b, Marco Antonio Montes-Cano b, Nieves Respaldiza b, José Martín-Juan c, José Manuel Varela a

a Servicio de Medicina Interna. Hospital Universitario Virgen del Rocío. Sevilla. España.
b Unidad de Investigación. Hospital Universitario Virgen del Rocío. Sevilla. España.
c Servicio de Neumología. Hospital Universitario Virgen del Rocío. Sevilla. España.

Palabras Clave

Infección por Pneumocystis. Resistencia a fármacos. Dihidropteroato sintetasa.

Keywords

Pneumocystis infection. Drug resistance. Dihydropteroate synthase.

Resumen

Fundamento y objetivo: Ante la falta de métodos de cultivo se han tenido que desarrollar técnicas moleculares basadas en la identificación de mutaciones puntuales en el gen de la dihidropteroato sintetasa (DHPS) para reconocer la presencia de cepas de Pneumocystis jiroveci resistentes a sulfamidas. El objetivo de nuestro estudio fue conocer la frecuencia de dichas cepas en nuestro medio, ya que hasta el momento se carecía de información sobre este punto en España. Pacientes y método: Se incluyeron todos los casos de neumonía por Pneumocystis identificados a lo largo de 2 años en nuestro centro. El diagnóstico se realizó mediante una técnica de reacción en cadena de la polimerasa anidada en muestras de lavado broncoalveolar. Se utilizaron los cebadores DHPS-3 y DHPS-4 para amplificar un fragmento del gen de la DHPS y se identificaron las mutaciones relacionadas con resistencia mediante el análisis de polimorfismos de restricción. Resultados: Se pudo amplificar el gen de la DHPS en 9 de los 12 casos identificados (75%), 3 de los cuales (33,3%) presentaban alguna de las mutaciones vinculadas con la resistencia a sulfamidas. Conclusiones: En nuestro medio existen con relativa frecuencia neumonías por P. jiroveci causadas por cepas con mutaciones vinculadas a resistencia a sulfamidas.

Abstract

Background and objective: The absence of culture methods to recognize the presence of resistance to sulfa or sulfone drugs in Pneumocystis jiroveci has led to develop molecular techniques based on the identification of mutations in the dihydropteroate synthase gene (DHPS). The aim of this study was to determine the frequency of these mutations in our geographical area, since in Spain there is no information concerning this issue. Patients and method: The study included all Pneumocystis pneumonia cases identified in our hospital during two years. Diagnosis was made by nested PCR in bronchoalveolar lavage samples. DHPS-3 and DHPS-4 primers were used to amplify the DHPS gene and mutations associated with sulfa resistance were identified using a restriction fragment length polymorphism assay. Results: In 9 out of the 12 cases identified, DHPS could be amplified (75%) from which 3 (33.3%) showed some mutation linked to sulfa resistance. Conclusions: In our area, we have found a relatively high frequency of pneumonia caused by P. jiroveci's strains with mutations associated with sulfa resistance.

Artículo

Aunque la incidencia de la neumonía por Pneumocystis jiroveci (NPj), previamente conocido comoPnemocystis carinii sp. f. hominis1, ha disminuido en los pacientes con sida en los países desarrollados con el empleo de quimioprofilaxis específica y sobre todo con el uso del tratamiento antirretroviral de gran actividad, continúa siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad, no sólo en sujetos con infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), en quienes constituye la enfermedad definitoria de sida más frecuente en Europa occidental, sino en otros sujetos sometidos a inmunodepresión como los receptores de trasplantes, los pacientes con enfermedades autoinmunitarias o los sujetos con procesos neoplásicos2.

El cotrimoxazol, combinación de trimetoprima y sulfametoxazol, constituye el fármaco de elección para la profilaxis y el tratamiento de la NPj, tanto en pacientes con sida como en sujetos con otras causas de inmunodepresión2. La mayor parte de la actividad anti-Pneumocystis radica en el sulfametoxazol, cuya diana de acción es la dihidropteroato sintetasa (DHPS)3. Se ha descrito la existencia de mutaciones puntuales en regiones conservadas del gen de la DHPS de diferentes microorganismos como Streptococcus pyogenes o Plasmodium falciparum que confieren resistencia a las sulfamidas4,5. Mutaciones de este tipo se han identificado en aislados de P. jiroveci procedentes de pacientes con NPj pero, dado que P. jiroveci no puede cultivarse in vitro, los métodos tradicionales para medir la resistencia a fármacos no han podido emplearse. Sin embargo, varios estudios han mostrado recientemente que la presencia de mutaciones puntuales, 55Thr * Ala y 57Pro * Ser en el gen de la DHPS de P. jiroveci, está asociada con el fracaso de la profilaxis con cotrimoxazol o dapsona y empeoran el pronóstico de la NPj en pacientes con sida6,7.

En España se carece de información sobre la frecuencia de cepas de P. jiroveci con mutaciones en el gen de la DHPS. Por ello, el objetivo de este estudio fue conocer la tasa de cepas de P. jiroveci con mutaciones en el gen de la DHPS en sujetos que desarrollan NPj en nuestro medio.

Pacientes y método

Se incluyeron en el estudio todos los casos de NPj identificados en nuestro hospital entre enero de 2001 y enero de 2003 que habían sido remitidos al gabinete de broncoscopia para realización de lavado broncoalveolar. El diagnóstico de NPj se realizó ante la existencia de un cuadro clinicorradiológico compatible y la identificación del patógeno mediante inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonares específicos (DAKO, Glostrup, Dinamarca) y/o reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En todos los casos se obtuvieron datos demográficos y clínicos de los pacientes y se conservaron en frío a ­80 °C muestras de lavado broncoalveolar para su posterior análisis.

El ADN de P. jiroveci se extrajo de las muestras de lavado broncoalveolar tras digestión con proteinasa K, utilizando un equipo comercial (Quiagen, Hilden, Alemania). Se amplificaron 2 locus independientes del genoma de P. jiroveci: el gen de la región mitocondrial (mtLSU rRNA) y el gen que codifica la síntesis de la enzima DHPS.

La amplificación de la región mtLSU rRNA se realizó mediante una técnica de PCR anidada. Para la primera ronda de amplificación se utilizaron los cebadores externos pAZ102-E (5'-GAT GGC TGT TTC CAA GCC CA-3') y pAZ102-H (5'-GTG TAC GTT GCA AAG TAC TC-3') y se obtuvo un fragmento de 346 pares de bases (pb); posteriormente se realizó una segunda ronda de amplificación utilizando los cebadores pAZ102-X (5'-GTG AAA TAC AAA TCG GAC TAGG-3') y pAZ102-Y (5'-TCA CTT AAT ATT AAT TGG GGA GC-3') y se obtuvo un producto de 260 pb. Los productos de ambas reacciones, PCR primaria y PCR anidada, se revelaron por electroforesis en gel de agarosa al 1,5% que contenía bromuro de etidio, y las bandas se visualizaron mediante luz ultravioleta.

El gen de copia única de la DHPS se amplificó utilizando los cebadores DHPS-3 (5'-GCG CCT ACA CAT ATT ATG GCC ATT TTA AAT C-3') y DHPS-4 (5'-GGA ACT TTC AAC TTG GCA ACC AC-3') en todas las muestras positivas por PCR anidada, utilizando un protocolo de Touchdown PCR, y se obtuvo un fragmento de 370 pb.

Para evitar falsos positivos debido a contaminación, en todas las etapas se utilizaron puntas de pipeta con filtro. La extracción de ADN, preparación de la mezcla de reacción, amplificación por PCR y detección se efectuaron en distintos recintos. Para detectar la posible contaminación cruzada, todas las reacciones de PCR llevaban como control negativo H2O estéril.

Los productos de la reacción de la PCR se dividieron en tres alícuotas. La primera se utilizó para identificar la presencia de cepas silvestres frente a la mutación en el codón 55 mediante la digestión durante 2 h a 37 °C utilizando 1 U de la enzima AccI (Roche Diagnostics, Alemania) que escinde el producto de la PCR si se trata de una cepa silvestre sin mutación en dicho codón8. La segunda alícuota se utilizó para identificar la presencia de cepas silvestres frente a la mutación en el codón 57 empleando la enzima HaeIII (Roche Diagnostics, Alemania) mediante el mismo protocolo8. La última alícuota con 370 pb sin cortar se utilizó como prueba de la amplificación por PCR del gen de la DHPS.

Cuando una muestra con cepas silvestres sin mutación en el codón 55 se somete a digestión con la enzima AccI, se detectan 2 fragmentos de ADN de 229 pb y 141 pb, respectivamente; mientras que si la mutación está presente se detecta una sola banda no cortada de 370 pb. De la misma forma, con la enzima HaeIII se detectan 2 fragmentos de 221 y 149 pb cuando existe una cepa silvestre sin mutación en el codón 57, y una sola banda no cortada de 370 pb si la mutación está presente (fig. 1).

Fig. 1. Ejemplo del resultado del análisis de los polimorfismos de restricción usando las enzimas AccI y HaeIIIen un caso con mezcla de cepas silvestres y de cepas con mutación en el codón 55. La columna A representa el control de pesos moleculares expresados en pares de bases (pb). En la columna B, que muestra la acción de la enzima AccI, se aprecia un fragmento de 370 pb sin escindir por la presencia de la mutación en el codón 55, además de 2 fragmentos escindidos de 229 y 141 pb debido a la existencia simultánea de cepas sin mutación en dicho codón. En la columna C, que muestra la acción de la enzima HaeIII, se observan la ausencia del fragmento de 370 pb y la presencia de 2 fragmentos escindidos de 221 y 149 pb debido a que sólo están presentes cepas silvestres sin mutación en el codón 57.

Resultados

Se identificaron 12 casos de NPj, 3 mujeres y 9 varones, con una edad media de 39,75 años (intervalo, 28-52). Once casos correspondían a sujetos con infección por el VIH y un caso a un paciente que había recibido un trasplante renal. El diagnóstico microbiológico se realizó en todos los casos mediante la amplificación por PCR de la región mtLSU rRNA; además 7 casos presentaron positividad de la inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonales específicos.

En 9 de los 12 casos identificados (75%) se pudo amplificar el producto del gen de la DHPS, que en 3 casos (33,3%) presentó mutaciones vinculadas a resistencia a sulfamidas. En un caso se identificaron mutaciones tanto en el codón 55 como en el 57, y en 2 casos la presencia concomitante de cepas silvestres y con mutaciones en el codón 55 y 57. De los pacientes que presentaban mutaciones en el gen de la DHPS, sólo uno había tenido exposición previa a sulfamidas (tabla 1).

En 10 pacientes se utilizó tratamiento con cotrimoxazol y en 2 pentamidina por alergia previa a sulfamidas. En todos los casos se consiguió la recuperación de los pacientes, aunque en 3 de ellos la evolución fue tórpida, sin que pudiera establecerse relación con la presencia o no de mutaciones.

Discusión

Nuestro estudio muestra por primera vez la presencia en España de cepas de P. jiroveci con mutaciones en el gen de la DHPS vinculadas a resistencia a sulfamidas en pacientes con neumonía por este patógeno.

En nuestro estudio se pudo amplificar mediante PCR fragmentos del gen de la DHPS en 9 de los 12 pacientes con NPj, lo que supone una tasa de amplificación del 75%, totalmente superponible a lo comunicado en trabajos previos realizados en este tipo de pacientes, en que dicha tasa oscila entre un 72 y un 77%6,7. Aunque el número de pacientes analizados fue pequeño, la tasa de mutaciones vinculadas a resistencias a sulfamidas encontrada fue similar a la descrita recientemente en Italia (40%)9 e inferior a la descrita en EE.UU. donde llega a más del 70%10.

El desarrollo de mutaciones en la DHPS se ha relacionado en los pacientes con infección por el VIH con el empleo previo y la duración de la quimioprofilaxis con cotrimoxazol o dapsona6. Sin embargo, la constatación de cepas de P. jiroveci con mutaciones en la DHPS en pacientes que no habían tomado previamente derivados de las sulfamidas, como sucede en nuestro estudio, indicaría la posibilidad de transmisión de estas cepas entre sujetos con infección por el VIH que emplean frecuentemente quimioprofilaxis con cotrimoxazol6, o bien la existencia de mutaciones espontáneas.

Aunque varios estudios clínicos han relacionado la presencia de mutaciones en el gen de la DHPS con el fracaso de la quimioprofilaxis con cotrimoxazol o dapsona6 y la mayor mortalidad de los pacientes que presentan NPj7, esta última relación no ha sido comprobada en otros trabajos10. Estas diferencias podrían estar relacionadas con diferencias en el diseño de los estudios, ya que en un caso se consideraba sólo la mortalidad durante el tiempo de hospitalización10 y en otro, la tasa de supervivencia a los 3 meses tras el diagnóstico del último episodio de NPj7. Sin embargo, otra posible explicación podría ser que, aunque las mutaciones en el gen de la DHPS contribuyeran al desarrollo de resistencias a las sulfamidas, fuera necesaria la presencia de otras mutaciones aún no identificadas, en el mismo gen de la DHPS o en otro relacionado, para conferir significación clínica a la resistencia10. En nuestro estudio, el pequeño tamaño de la población analizada impide obtener conclusiones sobre este punto.

No obstante, la identificación de mutaciones en el gen de la DHPS podría constituir uno más de los criterios que pueden guiar al clínico en la elección del tratamiento frente a la infección por P. jiroveci, aunque son necesarios estudios más amplios que definan mejor el papel real de la determinación de estas mutaciones en la práctica clínica.

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