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© Thomson Reuters, Journal Citation Reports, 2013

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doi: 10.1016/j.rppneu.2012.09.002

Avaliação do equilíbrio entre oxidantes e antioxidantes na patogénese da doença pulmonar obstrutiva crónica

Evaluation of the oxidant and antioxidant balance in the pathogenesis of Chronic Obstructive Pulmonary Disease

C. Cristóvão a, , L. Cristóvão bcde, F. Nogueira a, M. Bicho e

a Serviço de Pneumologia, Centro Hospitalar de Lisboa Ocidental, Hospital de Egas Moniz, Lisboa, Portugal
b Faculdade de Ciências Biomédicas, Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologias de Lisboa, Lisboa, Portugal
c Faculdade de Engenharia e Ciências Naturais, Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologias de Lisboa, Lisboa, Portugal
d Unidade de Biotecnologia Ambiental, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade Nova de Lisboa, Lisboa, Portugal
e Laboratório de Genética, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, Lisboa, Portugal

Palavras-chave

Doença pulmonar obstrutiva crónica. Stress oxidativo. Peroxidação lipídica. Antioxidantes.

Keywords

Chronic obstructive pulmonary disease. Oxidative stress. Lipid peroxidation. Antioxidants.

Resumo

A doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC) é uma das doenças crónicas mais comuns e representa uma importante causa de morbilidade e mortalidade. Um desequilíbrio entre oxidantes e antioxidantes (stress oxidativo) tem sido proposto como um acontecimento importante na patogénese da DPOC. O aumento do stress oxidativo em doentes com DPOC é o resultado da presença de oxidantes exógenos, nomeadamente, poluentes e fumo do tabaco, assim como oxidantes endógenos produzidos durante a inflamação. O objetivo do presente estudo consistiu em clarificar a hipótese sobre a existência de um desequilíbrio entre oxidantes e as defesas antioxidantes associado à DPOC. Neste estudo, avaliou-se um biomarcador do stress oxidativo (malonildialdeído, um produto resultante da peroxidação lipídica) e antioxidantes não-enzimáticos (vitamina C e grupos sulfidrilo), em doentes com DPOC e em controlos saudáveis. Observou-se um aumento significativo (p < 0,001) do marcador do stress oxidativo nos doentes com DPOC comparativamente ao grupo controlo. Não foram encontradas alterações dependentes da idade nos níveis dos produtos da peroxidação lipídica. Os doentes DPOC apresentaram uma diminuição significativa (p < 0,001) do status antioxidante, comparativamente ao grupo controlo. Os nossos resultados evidenciam que o stress oxidativo representa uma importante alteração fisiopatológica na DPOC.

Abstract

Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) is one of the most common chronic diseases and a major cause of morbility and mortality. An imbalance between oxidants and antioxidants (oxidative stress) has been proposed as a critical event in the pathogenesis of COPD. The increased oxidative stress in patients with COPD is the result of exogenous oxidants namely pollutants and cigarette smoke as well as endogenous oxidant production during inflammation. The aim of the present study was to clarify the hypothesis about the presence of an imbalance between oxidants and the antioxidant defences associated to COPD. In this study, we evaluated a biomarker of oxidative stress (malondialdehyde, a lipid peroxidation derived product) and non-enzymatic antioxidants (vitamin C and the sulphydryl groups) in COPD patients and healthy controls. The marker of oxidative stress was found to be significantly (p < 0,001) higher in COPD patients when compared with the control group. No age dependent changes in the plasma levels of lipid peroxidation products were found. COPD patients had a significant (p < 0,001) decrease in antioxidant status compared with control group. Our results show that oxidative stress is an important pathophysiologic change in COPD.

Artigo

Introdução

A doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC) é uma das doenças crónicas mais comuns e representa uma importante causa de morbilidade e mortalidade1, 2, 3. Têm surgido evidências experimentais sobre um desequilíbrio entre oxidantes/antioxidantes, a favor das espécies reativas oxidantes (stress oxidativo), associado à DPOC2, 4, 5, 6, 7, 8. O envolvimento do stress oxidativo na patogénese da DPOC parece ser determinante para a manifestação da resposta inflamatória do pulmão9, 10, 11, 12, 13. O aumento do stress oxidativo em doentes com DPOC resulta da ação de oxidantes exógenos (tais como os poluentes atmosféricos e componentes do tabaco), assim como oxidantes endógenos, produzidos durante o processo inflamatório. Contudo, existem numerosos resultados inconsistentes em estudos sobre desequilíbrio oxidante e antioxidante associado à patogénese da DPOC14, 15. Um dos principais alvos do stress oxidativo são os ácidos gordos polinsaturados presentes nas membranas celulares16, 17. As espécies oxidantes conduzem a um processo de várias etapas que, na sua globalidade, é classificado como peroxidação lipídica. Existem vários produtos resultantes da peroxidação lipídica, sendo de considerar entre eles um dialdeído (malonildialdeído [MDA]) com reconhecida ação lesiva a nível do genoma humano, sendo considerado um potencial agente genotóxico e clastogénico18. Neste sentido, a avaliação do MDA em amostras biológicas é considerada um indicador do aumento da peroxidação lipídica e, consequentemente, da lesão oxidativa in vivo16, 19, 20.

Existe evidência de que o stress oxidativo se manifesta em circulação por uma falência da capacidade antioxidante plasmática (vitamina C, vitamina E, β-caroteno e sulfidrilos) associada aos hábitos tabágicos. De modo semelhante, ocorre uma falência na capacidade antioxidante plasmática nas exacerbações da DPOC5, 13. Estudos epidemiológicos demonstraram uma relação entre o aumento da ingestão de vitaminas antioxidantes C e E com a diminuição da prevalência de bronquite crónica em fumadores21.

O principal objetivo deste estudo consistiu em clarificar a hipótese formulada sobre a existência de um desequilíbrio entre a produção de espécies oxidantes e a defesa antioxidante, associado à patogénese da DPOC.

Material e métodos População em estudo

Foram estudados 20 doentes (média da idade 71,30 ± 7,68 anos) com DPOC estável (sem história de exacerbações há mais de 6 meses): 15 com história tabágica e 5 não-fumadores, com exposição tabágica passiva ou exposição ocupacional. As características clínicas e fisiológicas do grupo DPOC estão apresentadas na Tabela 1. Nos ex-fumadores, a cessação tabágica ocorreu pelo menos um ano antes da sua participação neste estudo. Foi estudado como controlo um grupo de 50 indivíduos saudáveis (média da idade 41,60 ± 12,31 anos; 12 do sexo feminino, 38 do sexo masculino e índice de massa corporal, IMC 27,322 ± 4,310 kg/m2) sem antecedentes de doença pulmonar. Doze destes indivíduos eram fumadores e 38 não fumadores.

Tabela 1. Características clínicas e fisiológicas dos doentes DPOC

Parâmetros clínicos e fisiológicos Valores
Idade, anos 71,30 ± 7,68
Sexo masculino/feminino, n 11/9
Índice de massa corporal, kg/m2 27,918 ± 1,724
Hábitos tabágicos: ex-fumadores/não fumadores, n 15/5
N.° unidades maço/ano nos ex-fumadores 68,8 ± 10,754
Estadio GOLD: I/II/IV, n 2/4/14
FVC, % do previsto 77,100 ± 5,190
FEV1, % do previsto 58,130 ± 5,332
FEV1/FVC, % 59,453 ± 3,805
paO2, mmHg 66,700 ± 2,71

O stress oxidativo foi avaliado no plasma através da determinação dos níveis do biomarcador MDA em doentes com DPOC e no grupo controlo. O status antioxidante foi avaliado pela quantificação da vitamina C e dos grupos sulfidrilo (-SH) totais, através de métodos espetrofotométricos.

O estudo foi realizado de acordo com as normas da declaração de Helsínquia. O consentimento informado foi obtido para todos os indivíduos que participaram neste estudo.

Métodos Determinação do malonildialdeído plasmático

O biomarcador sistémico do stress oxidativo foi avaliado no plasma através da quantificação dos níveis de um produto resultante da peroxidação lipídica, o MDA. As concentrações de MDA foram determinadas espetrofotometricamente em termos das substâncias que reagem com o ácido tiobarbitúrico (TBARS), usando o método modificado a partir de Okhawa et al.22 Foram lidas as absorvências a 532 nm correspondentes ao complexo corado formado entre o MDA e o ácido tiobarbitúrico (TBA). A concentração das TBARS foi calculada através das concentrações de MDA e usando uma curva de calibração previamente elaborada. As concentrações de MDA são expressas em nmol/mL de plasma.

Quantificação da vitamina C

Os níveis de vitamina C foram monitorizados através do método descrito por Omaye et al.23 Resumidamente, a dinitrofenilhidrazina reage com o estado oxidado da vitamina C (ácido ascórbico oxidado) com formação de um produto corado. As absorvências lidas a 520 nm são diretamente proporcionais à concentração de vitamina C. Os níveis de vitamina C são expressos em μg/mL de plasma.

Determinação dos grupos sulfidrilo não proteicos

Os grupos sulfidrilo não proteicos existem maioritariamente sob a forma do glutationo reduzido (GSH). Avaliámos os grupos sulfidrilo aplicando o método espetrofotométrico envolvendo a utilização do reagente de Ellman24. O ácido 5,5’-Ditiobis(2-nitrobenzóico) (DTNB) sofre uma modificação química na presença de grupos sulfidrilo, ocorrendo a formação do anião 5-tio-2-nitrobenzoato (TNB). A absorvência deste produto corado lida a 412 nm é diretamente proporcional à concentração de GSH. Os níveis de grupos sulfidrilo são expressos em μmol/mL de plasma.

Análise estatística

Os resultados das concentrações dos parâmetros plasmáticos avaliados são expressos em valores médios ± SEM. Foi aplicado teste estatístico não paramétrico sempre que os resultados não apresentaram uma distribuição normal. Para a comparação entre os dois grupos estudados foram usados o teste t não emparelhado ou o teste de Mann-Whitney. Foram consideradas estatisticamente significativas as diferenças com p < 0,05.

Resultados Stress oxidativo e status antioxidante

As concentrações plasmáticas de MDA, vitamina C e grupos sulfidrilo dos doentes com DPOC (total doentes, doentes não fumadores e ex-fumadores) e do grupo controlo são apresentados na Tabela 2. Observou-se um aumento significativo (p < 0,001) do marcador do stress oxidativo (TBARS avaliados pelo MDA produzido) nos doentes DPOC comparativamente ao grupo controlo. A Figura 1 apresenta os níveis de MDA plasmático nos controlos e nos doentes DPOC. Não se encontraram diferenças significativas nos níveis de MDA associados à idade. Adicionalmente, observou-se uma diferença significativa entre controlos e doentes DPOC não fumadores (p < 0,01) e ex-fumadores (p < 0,001). Os nossos resultados mostraram não haver diferença significativa nos TBARS dos doentes DPOC ex-fumadores em comparação com os doentes DPOC não fumadores. Contudo, observou-se um aumento do marcador do stress oxidativo associado aos doentes ex-fumadores.

Tabela 2. Níveis de MDA plasmático e status antioxidante dos grupos estudados

  Controlos (n = 50) DPOC total (n = 20) DPOC não fumadores (n = 5) DPOC ex-fumadores (n = 15)
MDA (nmol/mL) 3,830±0,310 8,549±1,228 7,268±2,309 8,976±1,472
Vitamina C (μg/mL) 6,230±0,220 1,866±0,353 2,119±0,770 1,782±0,408
Grupos sulfidrilo (μmol/mL) 0,275±0,011 0,135±0,022 0,130±0,021 0,137±0,029

Valores expressos em média ± SEM.

Níveis de malonildialdeído (MDA) plasmático dos controlos e dos doentes DPOC. Valores expressos em média ± SEM. Diferença significativa (p < 0,001) entre controlos e total de doentes DPOC. Diferença significativa (p < 0,01) entre controlos e doentes não fumadores. Diferença significativa (p < 0,001) entre controlos e doentes ex-fumadores. Diferença não significativa entre doentes DPOC não fumadores e ex-fumadores.

Figura 1. Níveis de malonildialdeído (MDA) plasmático dos controlos e dos doentes DPOC. Valores expressos em média ± SEM. Diferença significativa (p < 0,001) entre controlos e total de doentes DPOC. Diferença significativa (p < 0,01) entre controlos e doentes não fumadores. Diferença significativa (p < 0,001) entre controlos e doentes ex-fumadores. Diferença não significativa entre doentes DPOC não fumadores e ex-fumadores.

Os doentes DPOC apresentaram uma diminuição significativa (p < 0,001) no status antioxidante (vitamina C e grupos sulfidrilo) comparativamente ao grupo controlo (Figura 2). Não foi observada diferença significativa entre doentes DPOC não fumadores e ex-fumadores. No entanto, verificou-se uma diminuição da vitamina C associada aos doentes ex-fumadores.

Concentração plasmática de vitamina C e grupos sulfidrilo nos controlos e doentes DPOC. Valores expressos em média ± SEM. Doentes DPOC apresentaram diminuição significativa (p < 0,001) no <i>status</i> antioxidante (vitamina C e grupos –SH) comparativamente ao grupo controlo.

Figura 2. Concentração plasmática de vitamina C e grupos sulfidrilo nos controlos e doentes DPOC. Valores expressos em média ± SEM. Doentes DPOC apresentaram diminuição significativa (p < 0,001) no status antioxidante (vitamina C e grupos –SH) comparativamente ao grupo controlo.

Discussão e conclusões

Os oxidantes promovem a peroxidação lipídica na membrana celular. A deteção de um produto da peroxidação lipídica no plasma, nomeadamente o MDA, é uma ferramenta útil para demonstrar a ocorrência de stress oxidativo in vivo. O objetivo do presente estudo consistiu na comparação entre um grupo de doentes com DPOC e um grupo controlo, relativamente à produção de MDA e aos níveis de antioxidantes, vitamina C e grupos tiol. Os nossos resultados demonstraram que o stress oxidativo é uma importante alteração fisiopatológica na DPOC. O aumento dos produtos da peroxidação lipídica no plasma dos doentes com DPOC suporta a hipótese do stress oxidativo associado à doença. De acordo com os nossos resultados, o aumento do stress oxidativo é mais evidente nos doentes com hábitos tabágicos, apesar de não termos encontrado diferenças significativas quer na peroxidação lipídica quer no status antioxidante em doentes não fumadores e ex-fumadores. Paralelamente, não observámos diferença significativa no marcador do stress oxidativo e no status antioxidante entre saudáveis fumadores e não-fumadores. Rahman et al.25 observaram a formação de um produto da peroxidação lipídica em células do epitélio respiratório, células endoteliais, neutrófilos e macrófagos de fumadores com e sem DPOC. Estes autores concluíram que o stress oxidativo resultante do fumo do tabaco parece ser mais pronunciado nos indivíduos que desenvolveram DPOC. Estudos prévios apresentados por outros autores demonstraram não existir correlação entre os níveis de TBARS e de peróxido de hidrogénio na DPOC associada a hábitos tabágicos26. No entanto, e apesar de os nossos resultados serem preliminares, eles permitiram observar uma tendência para um aumento dos níveis de MDA associado a doentes DPOC com hábitos tabágicos.

Os antioxidantes são igualmente considerados como marcadores do stress oxidativo. Define-se como antioxidante qualquer substância que, quando presente mesmo a baixas concentrações, comparativamente ao substrato que se oxida, retarda ou inibe consideravelmente a oxidação do mesmo16. Os antioxidantes podem atuar em diferentes estadios da sequência oxidativa. O plasma contém uma diversidade de antioxidantes, nomeadamente a vitamina C e os grupos tiol. A diminuição dos antioxidantes plasmáticos poderá indicar a progressão biológica do stress oxidativo. Quando ocorre aumento de oxidantes e diminuição da defesa antioxidante, origina-se uma situação de stress oxidativo conducente a uma excessiva lesão a nível celular e tecidual16. Apesar de algumas limitações, a vitamina C plasmática tem sido considerada como um índice para a avaliação bioquímica do status desta vitamina23. A vitamina C plasmática é particularmente importante na diminuição da peroxidação lipídica no plasma induzida pela fase gasosa do fumo do tabaco in vitro27. Adicionalmente, foi sugerido o efeito protetor dos antioxidantes alimentares, tais como as vitaminas A, C e E, relativamente ao stress oxidativo na patogénese do enfisema em fumadores3. Paralelamente, outros estudos demonstraram o decréscimo da capacidade antioxidante em doentes com DPOC quando comparados com o controlo28, 29, 30. Contudo, existe uma divergência relativamente a outros estudos sobre a relação entre o status antioxidante e a função pulmonar em doentes com DPOC14. Isto devido ao facto de outros estudos não terem encontrado efeito protetor dos antioxidantes na função pulmonar30. Os mecanismos moleculares envolvendo a defesa antioxidante na DPOC permanecem ainda por esclarecer31, 32. Neste estudo, verificou-se uma diminuição significativa (p < 0,001) no status antioxidante (vitamina C e grupos sulfidrilo) nos doentes com DPOC quando comparado com o grupo controlo. Esta diminuição significativa da vitamina C e dos grupos sulfidrilo associada aos doentes com DPOC é concordante com a hipótese que relaciona o glutationo, considerado o sulfidrilo não proteico celular mais abundante, e o ciclo redox do glutationo, como um possível mecanismo antioxidante envolvido na proteção contra o stress oxidativo33. Os nossos resultados não apontam para uma diferença significativa no status antioxidante entre não fumadores e fumadores saudáveis nem entre não fumadores e ex-fumadores doentes. Contudo, observou-se uma tendência para a diminuição da vitamina C associada aos doentes DPOC com hábitos tabágicos.

Neste estudo, a diferença de idades entre os controlos e os doentes com DPOC pode ser considerada uma limitação. Com o intuito de observarmos o efeito da idade, comparámos os resultados dos indivíduos saudáveis com idade inferior e superior ou igual a 50 anos. Não foram observadas diferenças significativas no MDA plasmático e no status antioxidante associadas à idade. Este dado é apoiado por estudos de outros autores, pelo facto de não terem encontrado relação entre a capacidade antioxidante plasmática e sulfidrilos e a idade em indivíduos saudáveis21, 28. Outros estudos demonstraram que não existe alteração dos níveis plasmáticos de MDA com a idade, na população em geral34, 35. Simultaneamente, outros autores verificaram uma redução acentuada do MDA associada à patologia respiratória crónica, particularmente na DPOC.

Tem sido sugerido que o aumento dos níveis de MDA relacionado com a fisiopatologia da DPOC possa ser considerado um marcador promissor do stress oxidativo nas doenças pulmonares crónicas17.

No nosso estudo não foi analisado o efeito da oxigenoterapia. Contudo, o efeito desta terapêutica no stress oxidativo nos doentes com DPOC mantém-se controverso. Os nossos resultados evidenciaram uma diferença significativa no stress oxidativo e no status antioxidante entre controlos e doentes com DPOC, independente da oxigenoterapia. Não foram encontradas diferenças significativas associadas à oxigenoterapia. Mais estudos serão necessários de modo a clarificar os efeitos da oxigenoterapia nos doentes com DPOC.

Em conclusão, este estudo demonstrou que os níveis elevados de TBARS, nomeadamente um dos produtos finais do stress oxidativo, são mais pronunciados nos doentes com DPOC. Concomitantemente, foi observada uma diminuição significativa na proteção antioxidante associada à DPOC, quer em doentes não fumadores quer em ex-fumadores. O desequilíbrio entre oxidantes e antioxidantes poderá ser um evento importante associado à DPOC. Estes dados poderão ter implicações terapêuticas no futuro.

Conflito de interesses

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Agradecemos ao Professor J. Mexia, que muito contribuiu para a Análise Estatística deste trabalho. Estendemos o nosso agradecimento aos doentes DPOC e aos voluntários saudáveis que generosamente colaboraram neste estudo.


☆ Trabalho realizado no laboratório de Genética da Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa e nos laboratórios da Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologias de Lisboa.

Recebido 20 Fevereiro 2012
Aceito 14 Setembro 2012

Autor para correspondência. cristina.cristovao@iol.pt

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